Name: syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00
Duration: 9 min 58 s
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C.M.L. räumt Unterstützung dieser Arbeit durch die Air Force Office of Scientific Research (FA9550-14-1-0136), Harvard University Physik und Engineering Accelerator Award und eine nationale Institute der Gesundheit Direktor Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S räumt Unterstützung durch das Department of Defense (DoD) durch das National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG) Programm. G.h. entnimmt Gemeinschaft Unterstützung aus der American Heart Association (16POST27250219) und der Weg zur Unabhängigkeit Award (übergeordnete K99/R00) das National Institute on Aging von den National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde teilweise an der Harvard University Center für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, der von der National Science Foundation unter NSF ECCS Award Nr. unterstützt wird 1541959.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Alle Schritte in der Herstellung und der Einsatz von Mesh-Elektronik sind wichtig, aber ein paar sind besonders kritisch. Vor der Freigabe der Netz-Elektronik aus ihren Wafer, unbedingt oxidieren die Oberfläche um die Gitter leicht ausgesetzt in wässriger Lösung (Schritt 1.6.1) zu machen. Wenn dieser Schritt übersprungen, die Netze in der Regel auf der Oberfläche des Wassers Schwimmen, so dass sie schwer in die Nadeln zu laden, wenn sie geladen werden können, sie oft an den Seiten des Glas-Nadeln bleiben erfordern große Mengen (> 100 µL) für die Injektion. Nichtbeachtung die Oberfläche oxidieren vor Release, daher in der Regel bedeutet, dass die Maschen nicht verwendet werden können und die Herstellung muss von Anfang an erneut durchgeführt. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Netz-Elektronik biegen "Stamm", ~ 90° während das i/o Schnittstellen (Schritt 4.3). Wenn der Winkel kleiner als 90° ist, dann passt alle 32 I/O Pads in den ZIF-Anschluss nicht; Einige haben Ende erlauben das Einfügen, Verringerung der Zahl der angeschlossenen Elektroden abgeschnitten werden. Der Prozess muss auch sanft erfolgen, um die Stängel brechen zu verhindern.
Das Design des Netzes Elektronik kann für verschiedene Anwendungen angepasst werden, durch Ändern der Fotomasken und der gleichen Fertigung Verfahren in Abbildung 2dargestellt. Z. B. während die Netz-Elektronik-Sonden verwendet, um den Datensatz in Abbildung 9 32 Aufnahme Elektroden die Maus Hippocampus und primären somatosensorischen Cortex span haben sollen, kann die Platzierung der Elektrode innerhalb der ultraflexible Netz sein zu nahezu jedem Gehirn Region(en) gezielt ausgewählt können, oder größere Elektroden zur Stimulation eingebaute27. Das gleiche grundlegende Netz-Struktur und Herstellung-Verfahren werden beibehalten, aber die Platzierung der Elektrode und das Design werden angepasst, um den Bedürfnissen der Studie. Ermittler sollten vorsichtig, aber, und immer testen, ob die geänderte Designs leicht durch die beabsichtigte Nadeln injiziert werden können. Kleine Veränderungen an der Biegung Mechanik der Netz-Elektronik können erhebliche Auswirkungen auf die Injectability haben. Ein Beispiel dafür ist, dass ein Winkel von 45° zwischen Quer- und längs-SU-8-Bänder ergibt eine Netz-Elektronik-Sonde, die facilely eingespritzt werden kann aber ein 90° Winkel ergibt sich eine, zerknüllt und clogs Nadeln21.
Messung der Impedanz der Aufnahme Elektroden ist hilfreich für die Problembehandlung. Eine 20 µm Durchmesser kreisförmige Pt-Elektrode sollte eine Impedanz-Helligkeit in der Nähe von 1 MΩ, wenn bei einer Frequenz von 1 kHz in Vivo oder in 1 x PBS29gemessen haben. Eine Impedanz deutlich größer als das impliziert, dass die Elektrode nicht ausgesetzt, wie geschehen kann, wenn es mit Fotolack Rückständen kontaminiert ist, oder nicht elektrisch verbunden. Letzteres kann auftreten, zum Beispiel gibt es Staub auf der Foto-Maske während PL, die Ergebnisse in eine Trennung in der Au verbindet, ob eines der Gitter I/O Pads nicht durch das ZIF-Anschluss-Pins während I/O Schnittstellen kontaktiert wird. Eine Impedanz Helligkeit etwa die Hälfte der erwartete Wert legt nahe, dass der Kanal auf die angrenzenden, erstellen eine Schaltung von zwei Elektroden Impedanzen parallel zueinander kurzgeschlossen werden kann. Die gemessenen Impedanzwerte handeln als Leitfaden bei der Fehlersuche; in Kombination mit optischen Mikroskopie der Netz-Elektronik-Sonden, die Ursache des Problems kann in der Regel identifiziert und korrigiert werden entsprechend in der nächsten Fertigung laufen oder I/O Schnittstellen Versuch.
Der Einsatz von Spritze injizierbaren Netz Elektronik für akute Studien beschränkt sich insofern Monoblock-spiking Aktivität in der Regel nicht bis 1 Woche Post Injektion27 beobachtet ist, obwohl neuere Arbeiten (unveröffentlicht) zeigt, dass dieses Problem leicht überwinden ist. Wichtige Determinanten der Zeitaufwand zu sehen, Spick Aktivität sind die Maschen zu entwerfen, das Volumen der Flüssigkeit im Gehirn sowie Netz-Elektronik und der Durchmesser des verwendeten zur Injektion Nadel injiziert, wie diese der Gewebeschädigung während beeinflussen die Injektion und die Rate der Heilung. Große Einspritzmengen sein erforderlich, wenn die Netz-Elektronik nicht mit Sauerstoffplasma vor der Veröffentlichung in Ni Ätzmittel behandelt werden; Das heißt, wenn das Netz nicht hydrophil ist, kann es die glasnadel einhalten. Gelegentlich müssen die Maschen Mängel, die auf Biegung Mechanik die sie injizieren erschweren führen. Während des Ladens der Netz-Elektronik ist es wichtig zu überprüfen, dass Netze einfach und reibungslos in die Nadel bewegen (siehe ergänzende Video 1). Wenn dies nicht der Fall ist, sollte eine anderes Netz elektronische Sonde verwendet werden. Beste Ergebnisse für nahtlose neuronale Schnittstellen werden mit der ideale Einspritzmengen von 10 – 50 µL pro 4 mm der injizierten Maschenlänge erreicht werden. Neuere Ergebnisse mit feineren Netz Elektronik Sonden injiziert und/oder kleinere Durchmesser Kapillare Nadeln (so klein wie 150 µm Innendurchmesser, Außendurchmesser der 250 µm) zeigen, dass diese Einheit Spick von kurz nach der Injektion (akute Messungen) beobachtet werden können durch längere Zeiten. Maske-Design-Dateien für diese feineren Netz-Strukturen stehen auf Wunsch oder aus der Ressource-Website meshelectronics.org. Wir schätzen die Gesamtausbeute von unserer in-Vivo Netz Injektionsverfahren mit 400 µm Innendurchmesser (Außendurchmesser 650 µm) Nadeln bei etwa 70 %, obwohl die Ausbeute näher an 80-90 % für unsere neueren Arbeiten mit 150 µm Innendurchmesser (250 µm Außendurchmesser ) Nadeln. Die häufigsten Gründe für das Scheitern sind (1), dass das Netz injizieren nicht reibungslos, wodurch Hirnödem von unerwartet große Einspritzmengen in das Gehirn, (2) Netz Bruch während der manuellen Bearbeitung benötigt die i/o-Anbindung Verfahren und (3) Blutungen aus Beschädigung ein Blutgefäß während der Injektion. Ein Blutgefäß zu beschädigen, während der Einspritzung ist selten (die Ursache von weniger als 10 % der Ausfälle) und konnte reduziert werden weitere mithilfe von Image-guided-Surgery. Wir stellen auch fest, dass Schäden der Blutgefäße eine gemeinsame Einschränkung für alle Verfahren, die Durchdringung des Hirngewebes, einschließlich Injektion von viralen Partikel zur Transfektion, Implantation von starren Gehirn Sonden und Injektion von der Netz-Elektronik ist.
Mesh Elektronik Sonden sind stabil aus erfassen und verfolgen die gleichen einzelnen Neuronen auf mindestens Monate, Jahr Fristen und fast keine chronischen Immunantwort hervorrufen, wie in Abbildung 9 und Abbildung 10, bzw. demonstriert. Dies bietet erhebliche Vorteile im Vergleich zur Konvention Tiefe Elektroden, die häufig Leiden verringern Spike Amplituden, instabilen Signale und chronischen Entzündungen im Laufe des langfristigen Aufnahme Experimente14, 15. Darüber hinaus die Netz-Elektronik haben den Vorteil, dass sie in das Gewebe Links können während der histologischen Schnitt, Färbung, und bildgebende Verfahren, im Gegensatz zu herkömmlichen Sonden, die sind zu starr und müssen daher vor der Histologie entfernt werden Analysen. Daher erlauben Netz Elektronik für die einzigartige Fähigkeit, immunhistochemische Analyse verwenden, um die zelluläre Umgebung jeder Aufnahme Standort genau zu studieren.
Das Protokoll präsentiert hier öffnet-Up aufregende neue Möglichkeiten in den Neurowissenschaften. Die minimal-invasive Methode und nahtlose Integration von Netz-Elektronik mit Hirngewebe minimiert Unterbrechungen für neuronale Schaltkreise und vermeidet chronische Immunantwort, die meisten Arten von chronischen neuronalen Aufnahme Experimente profitieren könnten. Die Fähigkeit des Netzes Elektronik zu erfassen und verfolgen die gleichen einzelnen Neuronen für längere Zeit besonders von Interesse für die Ermittler wollen Millisekunde-Skala spiking Aktivität korrelieren mit Monat-Jahr-langen Prozessen wie Alterung, werden die Pathogenese der Erkrankung des Gehirns oder Gehirn Entwicklung16,18. Darüber hinaus gibt es erhebliche Möglichkeiten zu erweitern und passen Sie dieses Protokoll, z. B. die PCB Kopf-Bühne zu implementieren Funktionen wie digitale Multiplexen8,35, aktive Elektronik hinzugefügt wireless Kommunikation35,36,37und Signalverarbeitung35, Co Injektion von Stammzellen oder Polymere mit der Netz-Elektronik in Tissue Regeneration18,38Hilfe, 39und Einbeziehung Nanodraht – Feldeffekt-Transistoren (NW-FETs) in mesh Elektronik für stark lokalisiert und multifunktionale Gehirn Sonden24,29,40,41 ,42.

Die Entwicklung von Werkzeugen in der Lage, die Kartierung des Gehirns mit Single-Neuron Auflösung ist von zentraler Bedeutung für Neurowissenschaft und Neurologie. Nicht-invasive Technologien für neuronale Studien z. B. Elektroenzephalographie (EEG) Magnetoenzephalographie (MEG) und funktionelle Kernspintomographie (fMRI) haben für die Korrelation der Hirnaktivität mit Verhalten im Menschen1bewährt, 2, aber sie ermangeln die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich für die Untersuchung der Struktur und Dynamik von neuronalen Netzen in ihren grundlegenden Mikrometer und Millisekunde skaliert bzw.3,4. Bestimmte Electrocorticography (ECoG) Sonden und optische bildgebende Verfahren, die Spannung-empfindlichen Farbstoffen gelungen Aufnahme Monoblock-spiking Aktivität in Vivo5,6, doch sie gelten in der Regel nur in der Nähe der Gehirn-Oberfläche, Begrenzung der Anwendbarkeit auf Studien von flachen Hirnregionen. Im Gegensatz dazu können implantierbare elektrische Sonden Messen Single Neuron Elektrophysiologie im frei beweglichen Tieren aus nahezu jeder Region des Gehirns ohne die Notwendigkeit einer fluoreszierenden Etikettieren, macht sie unverzichtbar auf Systemebene Neurowissenschaften, vor allem als Microfabrication Techniken aus der Halbleiterindustrie geschoben haben zählt Kanal in die Hunderte und Tausende3,7,8,9. Aufgrund dieser Funktionen haben implantierbare elektrische Sonden viele wichtige Beiträge geleistet, Neurowissenschaften und Neurologie, einschließlich grundlegende Untersuchungen der Informationsverarbeitung in das visuelle System10, die Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit11und die Demonstration von Gehirn-Maschine-Schnittstellen (BMIs) für fortgeschrittene Prothetik12,13.
Jedoch hat langfristige Instabilität manifestiert sich vermindernden Spike Amplituden und instabilen Signale auf Zeitskalen von Wochen bis Monaten14,15 die Anwendbarkeit der implantierbaren Sonden zur Erforschung der relativ kurzfristigen begrenzt. Phänomene, Fragen zu verlassen, wie z. B. Hirnalterung und Entwicklung weitgehend unbeantwortet. Die Einschränkungen in langfristige Instabilität resultieren aus einem Missverhältnis zwischen herkömmlichen Sonden und Hirngewebe in Größe, Mechanik und Topologie14,15,16,17,18. In Bezug auf Größe, während neuronalen Synapsen und Somata etwa zehn Nanometern bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser19, bzw. traditionellen Sonden sind oft deutlich größer, bei Silizium Mikroelektrode Arrays > 4 mal die Größe eines einzelnen Neurons Zellkörper7,8. Die relativ große Größe der diese Sonden zur Beeinträchtigung der natürlichen Struktur und Vernetzung von dichten Nervengewebe, damit einen Beitrag zur chronischen Immunreaktion und stören die neuralen Schaltkreis untersucht. In Bezug auf die mechanischen Eigenschaften sind traditionelle Sonden erheblich stabiler als die extrem weiche Nervengewebe, in denen sie eingepflanzt werden; auch "flexible" Sonden aus 10 – 20 µm dicken Platten aus Polyimid hergestellt sind mindestens 100.000 Mal stabiler als Gehirn Gewebe20,21. Diese Diskrepanz in der Biegesteifigkeit bewirkt, dass relative scher Bewegung zwischen der Sonde und Gehirn Gewebe führt zu unzuverlässigen Monoblock-tracking bei längeren Aufnahmen und chronische Gliosis bei den Implantationsort induzieren. Schließlich schließt die topologische Struktur des konventionellen Gehirn Sonden unbedingt ein solides Volumen des Gewebes. Diese Diskrepanz in Topologie stört die Konnektivität des neuronalen Schaltkreise, schließt die natürliche dreidimensionale (3D) interpenetrated Verteilung von Neuronen, Gliazellen und Blutgefäßen im Gehirn Gewebe22und behindert 3D Transport von Signalisierung Moleküle23. Gemeinsam haben diese Unzulänglichkeiten der konventionellen Sonden sie unterschreiten die langfristige Kompatibilität für klinische Anwendungen und längs neurowissenschaftlichen Studien auf der Ebene der einzelnen Neuron gesucht gemacht.
Um diese Mängel zu überwinden, haben wir versucht, die Grenze zwischen den neuronalen und elektronischen Systemen durch die Entwicklung eines neuen Paradigmas der "Gewebe-Like" neuronale Sonden bezeichnet Netz Elektronik16,21,24zu verwischen. Netz-Elektronik befasst sich oben passende Größe, Mechanik und Topologie durch den Einbau von (1) strukturelle Merkmale der gleichen Nanometer Größe maßstabsgetreu Mikrometer von neuronalem Gewebe (2) mechanische Eigenschaften ähnlich denen von Hirngewebe und (3) ein 3D makroporöse-Topologie ist > 90 % offener Raum und beherbergt somit Durchdringung von Neuronen und Diffusion von Molekülen durch die extrazelluläre Umgebung. Netz-Elektronik-Sonden können gerade in bestimmten Gehirnregionen durch eine Spritze und Nadel, minimale akute Schäden während der Implantation auch in tiefen Regionen21,25geliefert werden. Neuronale Soma und Axone haben gezeigt, dass die offene 3D Mesh Sonde elektronikstruktur innerhalb von Wochen nach der Injektion, wodurch eine nahtlose, Gliosis-freie Schnittstelle zwischen Aufnahme Elektronik und den umliegenden Gehirn Gewebe21 durchdringen , 26 , 27. diese einzigartigen Eigenschaften ermöglichten Netz Elektronik Sonden stabil spiking Aktivität von der gleichen einzelnen Neuronen über mindestens ein Jahr Zeitskala27verfolgen. Darüber hinaus bietet die Herstellung von der Netz-Elektronik basierend auf Photolithographie (PL) hohen Skalierbarkeit der Anzahl von Elektroden, die eingebaut werden können, mit nachgewiesenen Kanal zählt bis zu 128 Elektroden pro Sonde mit einfachen Kontakt Maske Lithographie 28 und ein Plug-and-Play-Eingabe/Ausgabe (e/a) Design, die ermöglicht eine schnelle elektrische Verbindung zum peripheren Elektronik ohne Spezialausrüstung29.
Ein breites Spektrum an Studiengängen kann profitieren von Mesh-Elektronik in Messprotokolle zu integrieren. Die meisten intracortical Aufnahme Experimente könnten davon profitieren Mesh Elektronik minimalinvasive Implantationsverfahren mittels Spritze Injektion, die drastisch reduzierten Immunantwort nach der Implantation, und die Fähigkeit zu verlassen mesh-Elektronik in der Gewebe während nachfolgende Histologie und Immunostaining für die präzise Analyse der biologischen Umgebung jeder Aufnahme-Standort. Chronische Aufnahme Experimente werden vor allem die einzigartige Fähigkeit der Netz-Elektronik, große Anzahl von einzelnen Neuronen für Monate bis Jahre verfolgen Wert abgeleitet. Diese Möglichkeit schafft Chancen für Studien mit Single-Neuron-Auflösung, die zuvor nicht praktikabel, wie z. B. longitudinal Aging Studien der neuronalen Schaltkreise, Untersuchungen der entwickelnden Gehirn und Untersuchungen über die Pathogenese der waren Enzephalopathien16.
In diesem Protokoll beschreiben wir alles, was die wichtige in einem typischen Maus neuronalen Aufnahme Experiment mit Spritze-injizierbaren Netz Elektronik Schritte (siehe Abbildung 1). Beschriebenen Schritte umfassen die Herstellung von Mesh-Elektronik in eine standard-PL-basierten Prozess möglich an vielen Universitäten, laden Netz Elektronik in Kapillare Standardnadeln stereotaktischen Injektion von Mesh Elektronik in Vivo, Verbindung von der Mesh-I/O standard-Instrumentierung Schnittstellen, zurückhaltend oder frei beweglichen Aufnahmesessions und histologischen Schnitt des Gehirngewebes mit Mesh-Elektronik. Einige Forscher mit Netz Elektronik nur für Histologie Studien erfordern nicht unbedingt Elektrische Anbindung und Aufzeichnung, in welchem Fall sie diese Schritte überspringen können. Nachdem sich vertraut zu machen mit diesem Protokoll, müssen Ermittler alle notwendigen Kenntnisse zur Netz-Elektronik in ihre eigenen Experimente verwenden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Motorized stereotaxic frame</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MTM-3</td>
			<td>For mouse stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512-channel recording controller</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3004</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2132 amplifier board</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3314</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2000 3-ft ultra thin SPI interface cable</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3213</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-150&#160;STD</td>
			<td>Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafers</td>
			<td>Nova Electronic Materials</td>
			<td></td>
			<td>3&#34; P &#60;100&#62; .001-.005 ohm-cm 356-406&#956;m Thick 
			Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &#38; 
			6,000 A&#176;&#177;5% Wet Thermal Oxide on both sides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks (chrome on soda lime glass)</td>
			<td>Advance Reproductions</td>
			<td></td>
			<td>Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator</td>
			<td>Sharon Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000.5 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 mask aligner</td>
			<td>Karl Suss Microtec AG</td>
			<td></td>
			<td>Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOR3A lift-off resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipley 1805 positive photoresist</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-CD-26 positive photoresist developer</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Reynolds Tech</td>
			<td></td>
			<td>For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ plasma surface treatment system</td>
			<td>AST Products, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover PG</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride solution</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>415-1L</td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36% hydrochloric acid solution</td>
			<td>Kanto Corp.</td>
			<td></td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary needles</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder U-type</td>
			<td>Molecular Devices, LLC</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>NORM-JECT&#174;, Henke Sass Wolf</td>
			<td></td>
			<td>Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene intrademic catheter tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece camera</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>DCC1240C</td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXL-M40 dental drill</td>
			<td>Osada</td>
			<td>3144-830</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 mm drill burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-09</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer 14 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-50</td>
			<td>Used to sterlize surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1950 cryosectioning instrument</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Triton x-100</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Neurofilament</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8135</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>PA516291</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>Molecular weight = 70-150 kDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle end clamp</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>RA180/M</td>
			<td>Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed circuit board (PCB)</td>
			<td>Advanced Circuits</td>
			<td></td>
			<td>Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel standard amplifier connector</td>
			<td>Omnetics Connector Corp.</td>
			<td>A79024-001</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel flat flexible cable (FFC)</td>
			<td>Molex, LLC</td>
			<td>152660339</td>
			<td>Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-ch zero insertion force (ZIF) connector</td>
			<td>Hirose Electric Co., LTD</td>
			<td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology

Implantierbaren Gehirn Elektrophysiologie Sonden sind wertvolle Werkzeuge in den Neurowissenschaften aufgrund ihrer Fähigkeit zu Rekord neuronale Aktivität mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung von flachen und tiefen Hirnregionen. Ihr Einsatz behindert worden, jedoch durch mechanische und strukturelle Diskrepanzen zwischen den Sonden und das Gehirn Gewebe führen, häufig zum Integrationsprozess und Gliosis mit daraus resultierenden signal Instabilität in chronische Aufnahme Experimente. Im Gegensatz dazu nach der Implantation der ultraflexible Netz Elektronik mittels Spritze Injektion Sonden das Netz bilden eine nahtlose, Gliosis-freie Schnittstelle mit dem umliegenden Hirngewebe, das es stabile Tracking einzelner Neuronen auf mindestens ein Jahr ermöglicht Zeitskala. Dieses Protokolldetails die wichtigsten Schritte in einem typischen Maus neuronalen Aufnahme Experiment mit Spritze-injizierbaren mesh-Elektronik, einschließlich der Herstellung von Mesh-Elektronik in einem standard Photolithographie-basierten Prozess möglich an vielen Universitäten, be- Mesh-Elektronik in Kapillare Standardnadeln, stereotaktischen Injektion in Vivo, Verbindung des Netzes ein-/Ausgabe auf standard-Instrumentierung Schnittstellen, zurückhaltend oder frei beweglichen Aufnahme-Sessions und histologischen Schnitt des Gehirns mesh-Gewebe mit Elektronik. Repräsentative neuronale Aufnahmen und Histologie Daten werden vorgestellt. Ermittler vertraut mit diesem Protokoll werden die notwendigen Kenntnisse zur Netz-Elektronik in eigenen Experimenten integrieren und nutzen Sie die einzigartigen Möglichkeiten langfristig stabile neuronale Schnittstellen, wie Studien des Alterns haben Prozesse, die Entwicklung des Gehirns und der Pathogenese der Erkrankung des Gehirns.

Ergebnisse variieren je nach Tierart in der Studie, die gezielte Hirnregion, die verstrichene Zeit seit Injektion, die Menge des akuten Schadens während der Injektion und der Erfolg der i/o-Anbindung Verfahren, unter anderem. Monoblock-spiking Tätigkeit möglicherweise nicht angezeigt, bis 1 Tag (bei 150 µm Innendurchmesser Nadeln) bis 1 Woche nach der Injektion und Spike Amplituden für bis zu 4 – 6 Wochen variieren können. Abbildung 9 zeigt repräsentative elektrophysiologische Daten aus einer 32-Kanal-Netz Elektronik-Sonde in den Hippocampus und primären somatosensorischen Cortex eines erwachsenen männlichen C57BL/6J Maus injiziert. Ca. 300 µV Amplitude lokales Feld Potentiale (drängendere) wurden auf allen 32 Kanälen und Monoblock-spiking Aktivität wurde auf 26 Sender aufgenommen. Die drängendere und isolierten Spitzen zwischen 2 und 4 Monaten, eine hochstabile Schnittstelle zwischen Aufnahme Elektronik und Neuronen über diesen längeren Zeitraum vorschlagen ähnlich geblieben. Abbildung 10 zeigt repräsentative Ergebnisse der histologischen Schnitt und Immunostaining des Gehirngewebes mit Netz Elektronik 1 Jahr nach der Injektion. Für NeuN, ein Marker für die neuronalen Somata und Neurofilament, ein Marker für die neuronalen Axone Färbung zeigt wenig bis gar kein Verlust der Dichte Gewebe an der Injektionsstelle, was bedeutet nahtlose Anbindung zwischen dem Netz Elektronik und Gehirn Gewebe. Färbung für GFAP (ein Marker für Astrozyten) weiter offenbart in der Nähe von Hintergrundkonzentrationen von Astrozyten rund um die Netz-Elektronik, darauf hinweist, dass seine Anwesenheit wenig chronischen Immunreaktion hervorruft.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Abbildung 1: Schritte in eine Spritze-injizierbaren mesh Elektronik Experiment. Dieses Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte in einem typischen Nagetier neuronalen Aufnahme-Experiment mit Mesh-Elektronik. Experimente in der Regel mit sich bringen, in der Reihenfolge ihrer Durchführung, (1) Herstellung von Mesh-Elektronik, (2) Laden der Netz-Elektronik in Kapillare Nadeln (3) stereotaktischen Injektion von Mesh-Elektronik in das Gehirn, (4) Elektrische I/O Netz Anbindung Elektronik, (5) zurückhaltend oder frei beweglichen Aufnahmen und (6) Netz/Gewebe-Schnitt und Färbung für Histologie. In einigen Studien können nur die histologischen Daten erwünscht sein, in diesem Fall die Schritte (4) und (5) übersprungen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Herstellung Verfahren für Plug & Play Netz Elektronik im Großraum ultraflexible Gerät (obere Reihe), Stiel verbindet, Region (mittlere Reihe) und I/O Region (untere Reihe). (A) SU-8 negativer Photoresist (rot) ist gemustert mit PL-Maske-1 unten Passivierung Schicht jedes Plug & Play Netz-Elektronik-Sonde zu definieren. (B) Musterung mit PL-Maske-2, thermische Verdampfung und Metalldeckel definieren Au verbindet und I/O Pads (Gold). (C) Musterung mit PL-Maske-3, Electron Beam Verdunstung und Metalldeckel definieren Pt-Elektroden (blau). (D) SU-8 negativer Photoresist (rot) ist gemustert mit PL-Maske-4, die oberste passivierende Schicht zu definieren. Öffnungen in der SU-8 sind an jeder Pt-Elektrode und I/O Pad Links. (E) A abgeschlossen mesh Elektronik Sonde mit gestrichelten Boxen unter Angabe der Standorte in der oberen, mittleren und unteren Zeilen vergrößert. Fotomaske Design-Dateien sind auf Anfrage von den Autoren oder von der Ressource-Website meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Abbildung 3: Fotos und optischen Mikroskopbilder von Plug-and-Play-mesh Elektronik. (A) gefliest Lichtmikroskop Bilder einer Spritze-injizierbaren Netz Elektronik Sonde mit Plug-and-Play-i/o. Die Sonde wurde nach der Fertigstellung der Fabrikation in Abbildung 2 aber vor der Veröffentlichung von Ni-beschichteten Substrats Schritte abgebildet. Gestrichelte Kästchen entsprechen von links nach rechts, um die Abschnitte der ultraflexible Gerät Region, Stamm und I/O Region in C, D und E, bzw. vergrößert. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Foto von einem 3-Zoll-Si-Wafer mit 20 abgeschlossen mesh Elektronik Sonden. Maßstabsleiste = 20 mm. (C) optische Mikroskopbild von 20 µm Durchmesser Pt Aufnahme Elektroden im Großraum ultraflexible Gerät. Maßstabsleiste = 100 µm. (D) optische Mikroskopbild von High-Density-Au in der Stamm-Region verbindet. Jede Au Interconnect ist galvanisch getrennt und eine einzige Pt-Elektrode zu einem einzigen I/O Pad verbindet. Maßstabsleiste = 100 µm. (E) optische Mikroskopbild der I/O-Pads. Jedes Pad besteht aus einer zusammenklappbaren Mesh-Region und eine kontinuierliche Dünnschicht-Region auf dem Stamm. Non-Durchführung von SU-8 Bänder verbinden die Netz-Portionen der Pads zusammen zur Aufrechterhaltung des Ausrichtung. Maßstabsleiste = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Abbildung 4: Montage der Apparate für die Abhaltung der kapillarer Nadeln beim Einspritzen. (A) Foto der Komponenten des Geräts. Die Komponenten umfassen (1) eine Kapillare glasnadel, (2) eine Pipette Halter, (3) einer kreisförmigen Schraube Schraube für Inhaber der Pipette und (4) ein Kegel-Waschmaschine für die Pipette-Halter. Artikel (2) bis (4) sind mit Kauf von einer Pipette Halterung enthalten. Der Pfeil markiert das Outlet von der Pipette-Inhaber muss geschlossen mit Epoxy geklebt werden. (B) Lichtbild des Inhabers Pipette nach Montage und Einfügung einer Glas-Kapillare-Nadel. Die zusätzliche Epoxy ist sichtbar am oberen Ausgang des Pipette Halter (durch Pfeil markiert) und Kapillare Schläuche verbindet die Pipette-Halter mit einer Spritze (nicht dargestellt). (C) Foto von der Pipette-Inhaber und die Kapillare Nadel nach dem Anbau der stereotaktischen Rahmen mit einer rechtwinkligen Ende Klammer. Maßstabsleisten sind 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Abbildung 5: der Netz-Elektronik in Glas Nadeln laden. (A) schematische Darstellung der Ladevorgang für Plug & Play Netz Elektronik. Eine glasnadel ist nahe dem I/O Ende einer Netz-Elektronik-Sonde positioniert, während es in Lösung ausgesetzt ist. Der Spritzenkolben ist dann manuell zurückgezogen, um in der Netz-Elektronik-Sonde zu zeichnen. Ideale Positionierung ist mit der ultraflexible Gerät Region gleich hinter dem Ende der Nadel. (B) Fotos (A) entspricht einer Netz-Elektronik-Sonde in einer glasnadel geladen werden. Skalieren von Balken = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Abbildung 6: Schematische der stereotaktischen Chirurgie Station. Ein motorisierte stereotaktischen Rahmen (A) mit beiliegenden Pipette Halter wird verwendet, um die Nadel in die gewünschte Hirnregion zu positionieren. Die Position der Nadel und geladene Gitter Elektronik überwacht mit einem Objektiv und Kamera (B) angeschlossen und am Computer (C) angezeigt. Eine Spritzenpumpe (D) durchfließt genaue Mengen Kochsalzlösung die Nadel ermöglicht präzise, kontrollierte Einspritzung von Mesh-Elektronik in der gewünschten Hirnregion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Abbildung 7: Plug & Play I/O Anbindung Verfahren. (A) eine FFC spannen Substrat mit dental Zement angrenzend an die Kraniotomie gesichert wird. (B) Plug & Play Netz Elektronik in der gewünschten Hirnregion, die mit der FoV-Methode stereotaxically eingespritzt werden. (C) die Nadel, mit der I/O-Pads des Netzes Elektronik Sonde noch drinnen, wird über den FFC spannen Substrat verschoben. (D) Strömung wird durch die Nadel, die I/O-Pads auf der FFC spannen Substrat auszuwerfen fortgesetzt. (E) sind die I/O-Pads gebogen 90 ° bezogen auf Stamm, entfaltet mit der Durchführung von Seite nach oben, und im Ort getrocknet. (F) die FFC-Substrat wird mit einer Schere auf eine geradlinige ca. 0,5 mm von der Kante der I/O Pads getrimmt. Überschüssige Substrat schneiden entfernt, um das Einfügen in eine 32-Kanal-ZIF-Anschluss ermöglichen. (G) die i/o-Pads werden in eine 32-Kanal ZIF Steckverbinder montiert auf einer benutzerdefinierten Leiterplatte eingefügt. ZIF Connector ist verriegelt zu geschlossenen Kontakt mit den I/O-Pads. (H) die Verriegelung wird zementiert geschlossen, ist die Platine umgedreht auf den Schädel, und die Platine ist mit dental Zement fixiert. (ich) die Leiterplatte bildet eine kompakte Headstage mit einem standard Verstärker-Anschluss für die einfache Anbindung während der Aufnahme-Sessions. Skalieren von Balken = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Abbildung 8: zurückhaltend und frei beweglichen Aufnahmen. (A) Foto von einem männlichen C57BL/6J Maus in eine einschränkende während einer Aufnahme-Session. Eine 32-Kanal Vorverstärker-Platine wurde in den standard Verstärker Anschluss eingefügt. (B) Foto von der gleichen Maus mit 32-Kanal Vorverstärker PCB während eines frei beweglichen Aufnahme-Experimentes. Skalieren von Balken = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Abbildung 9: Repräsentative neuronalen Aufnahme Ergebnisse. (A) Vertreter LFP Heatmaps von 32-Kanal Elektronik-Sonden in der Maus Hippocampus und somatosensorischen Cortex injiziert Mesh. Daten wurden aufgenommen, während die Maus frei seinen Käfig auf 2 Monate (oben) und 4 Monate (unten) nach der Injektion untersucht. LFP-Amplitude ist farbkodiert entsprechend der farbigen Leiste auf der rechten Seite. Hochpass-gefilterte Spuren (schwarz) zeigt einen Aktivität sind für jede der 32 Kanäle das Spektrogramm überlagert. (B) Spikes isoliert nach Sortierung der Daten in (A) aufgetragen. Monoblock-spiking Aktivität wurde auf 26 der beiden 32 Kanäle 2 Monate nach der Injektion (oben) und 4 Monate nach der Injektion (unten) entdeckt. Die Zahlen über jedem Cluster Spitzen entsprechen die Kanalnummern in (A). Diese Zahl wurde von Fu, Et Al. modifiziert 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Abbildung 10: Repräsentative Histologie Ergebnisse. (A) Schema veranschaulicht die Ausrichtung des Mesh-Elektronik im Horizontal (mittlere Panel) und sagittale Gehirnscheiben (Bodenplatte). (B) Fluoreszenz Mikroskopbild eines 10 µm dicken kortikalen Gehirn Slice ein Jahr nach der Injektion ein 16-Kanal-Netz-Elektronik-Sonde. Die Scheibe wurde Immunostained für NeuN (grün). (C) die gleichen Gehirn-Scheibe Immunostained für Neurofilamente (rot). (D) das gleiche Gehirn Scheibe Immunostained für GFAP (Cyan). (E) ein zusammengesetztes Bild (b) bis (D) zeigt das Netz Elektronik/Gewebe mit beschrifteten NeuN (grün), Neurofilament (rot), GFAP (Cyan), Schnittstelle und mesh-Elektronik (blau). Skalieren von Balken = 100 µm. Diese Zahl wurde von Fu Et Al. modifiziert 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Video 1: wiederholt be- und Injektion von Mesh-Elektronik in Lösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Netz-Elektronik-Sonden nahtlos integrieren und sorgen für stabile, langfristige, Single Neuron Aufnahmen innerhalb des Gehirns. Dieses Protokoll verwendet Netz Elektronik für in Vivo Experimente, an denen die Herstellung von Mesh-Elektronik, laden in Nadeln, stereotaktischen Injektion ein-/Ausgabe-Schnittstellen, Aufnahme Experimente und Histologie des Gewebes mit Netz Sonden.

Spritze-injizierbaren Mesh Elektronik für stabile chronische Nagetier Elektrophysiologie

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

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