Name: syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00
Duration: 9 min 58 s
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C.M.L. reconhece apoio deste trabalho, o escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-14-1-0136), um prêmio de ciências físicas da Universidade de Harvard e acelerador engenharia e um institutos de saúde diretor nacional do Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. reconhece apoio pelo departamento de defesa (DoD) através do programa National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconhece apoio de comunhão da American Heart Association (16POST27250219) e o caminho para independência Award (pai K99/R00) do Instituto Nacional do envelhecimento dos institutos nacionais de saúde. Este trabalho foi realizado em parte no centro da Universidade de Harvard para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob NSF ECCS Award no. 1541959.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Todas as etapas de fabricação e o uso de malha eletrônica são importantes, mas alguns são especialmente críticos. Antes de lançar a malha eletrônica da sua bolacha, é essencial para oxidar a superfície para fazer as malhas prontamente suspensas em solução aquosa (etapa 1.6.1). Se esta etapa será pulada, as malhas geralmente flutuam na superfície da água, tornando-os difíceis de carregar para as agulhas, e se podem ser carregados, furam para os lados da agulha de vidro, que requerem grandes volumes (> 100 µ l) para a injeção. Falha para oxidar a superfície antes de lançamento, portanto, normalmente significa que as malhas não podem ser usadas e a fabricação devem ser re-interpretadas desde o início. Outro passo crítico é dobrar a malha eletrônica "haste" para ~ 90° durante a i/o interface (passo 4.3). Se o ângulo for menor do que 90°, então todos os 32 blocos de I/O não vão caber no conector ZIF; Alguns terão que ser cortar a extremidade para permitir a inserção, reduzindo o número de eletrodos conectados. O processo também deve ser feito com cuidado para evitar que o tronco quebrado.
O projeto da malha eletrônica pode ser personalizado para várias aplicações modificando as máscaras e usando o mesmo procedimento de fabricação descrito na Figura 2. Por exemplo, enquanto as sondas de malha eletrônica usadas para gravar os dados na Figura 9 foram projetadas para ter 32 gravação eletrodos abrangem o rato hipocampo e córtex somatossensorial primário, a colocação do eletrodo dentro da malha super flexível pode ser selecionado para praticamente qualquer cérebro região (ões)-alvo, ou maiores eletrodos para estimulação podem ser incorporado27. O mesmo procedimento de estrutura e de fabricação de malha básica são retidos, mas a colocação do eletrodo e o design são ajustadas para atender às necessidades do estudo. Investigadores deve usar de cautela, no entanto e sempre teste desenhos modificados podem ser injetados facilmente através das agulhas pretendidas. Pequenas alterações à flexão mecânica da malha eletrônica podem ter efeitos substanciais sobre Injectabilidade. Um exemplo é que um ângulo de 45° entre fitas de SU-8 transversais e longitudinais produz uma sonda eletrônica de malha que pode ser injectada facilely mas um ângulo de 90° resulta em um que amassa e entope agulhas21.
Medir a impedância dos eletrodos gravação é útil para solução de problemas. Um eletrodo de Pt-20 µm de diâmetro circular deve ter uma magnitude de impedância perto 1 MΩ quando medido com uma frequência de 1 kHz no vivo ou em 1X PBS29. Uma impedância significativamente maior do que isto implica que o eletrodo não é exposto, como pode acontecer se está contaminado com resíduos de fotorresiste, ou não eletricamente conectado. Este último pode ocorrer se, por exemplo, poeira sobre a máscara de fotografia durante o PL que resulta em uma desconexão no Au interconexões, ou se uma das almofadas do I/O de malha não é contactada pelos pinos do conector ZIF durante o interface I/O. Uma magnitude de impedância cerca de metade do valor esperado sugere que o canal pode ser curto para o adjacente, criando um circuito de duas impedâncias de eletrodo paralelamente uns aos outros. Os valores de impedância medidos agir como um guia durante a resolução de problemas; combinado com microscopia óptica das sondas malha eletrônica, a origem do problema pode geralmente ser identificada e corrigida em conformidade na fabricação próxima executar ou tentativa de interface I/O.
A utilização da seringa injetável malha eletrônica para estudos agudas é limitada em que a atividade de cravação unitárias geralmente não é observada até 1 semana pós injeção27, embora trabalhos recentes (não publicado) mostram que esta questão é facilmente superada. Determinantes do tempo necessário para ver o pico de atividade são a malha de design, o volume de líquido injetado no cérebro juntamente com malha eletrônica e o diâmetro da agulha usada para a injeção, como estas afetam o grau de danos no tecido durante o injeção e a taxa de cura. Volumes de injeção grande podem ser necessários se a malha eletrônica não é tratada com plasma de oxigênio antes do lançamento em Ni etchant; ou seja, se a malha não é hidrofílica, pode aderir na agulha de vidro. Ocasionalmente, as malhas têm defeitos que levam à flexão mecânica que os tornam difícil injetar. Durante o carregamento da malha eletrônica, é importante verificar que malhas são deslocam facilmente e suavemente a agulha (como mostrado no vídeo complementar 1). Se não, uma sonda eletrônica de malha diferente deve ser usada. Melhores resultados de interface neural sem emenda serão alcançados com os volumes de injeção ideal de 10-50 µ l por 4 mm de comprimento da malha injetado. Resultados mais recentes com sondas de eletrônica de malha mais finas injetada e/ou menor diâmetro capilar as agulhas (tão pequenas quanto 150 µm diâmetro interno, diâmetro externo de 250 µm) mostram aquela única unidade cravação pode ser observada desde logo após a injeção (medições agudas) através de tempos mais longos. Arquivos de projeto de máscara para essas estruturas mais finas de malha estão disponíveis por solicitação ou do site do recurso, meshelectronics.org. Estimamos que o rendimento global dos nossos na vivo malha injeção procedimentos usando 400 µm agulhas de (diâmetro externo de 650 µm) de diâmetro interno para cerca de 70%, embora o rendimento é mais perto de 80-90% para o nosso trabalho mais recente com 150 µm de diâmetro interno (250 µm diâmetro exterior ) agulhas. As razões mais comuns de falhas são (1) que a malha não injectar suavemente, resultando em edema cerebral de volumes de injeção inesperadamente grande no cérebro, ruptura de malha (2) durante a manipulação manual exigida na e/s interface de procedimento e (3) sangramento de danificar um vaso sanguíneo durante a injeção. Danificar um vaso sanguíneo durante a injeção é raro (a causa de menos de 10% de falhas) e poderia ser reduzido ainda mais usando a cirurgia guiada por imagem. Constatamos também que o dano dos vasos sanguíneos é uma limitação comum de todos os procedimentos que envolvem a penetração do tecido cerebral, incluindo injeção de partículas virais para transfeccao, implantação de sondas de cérebro rígida e injeção da malha eletrônica.
Malha eletrônica sondas são capazes de estàvel gravar e rastrear os mesmos neurônios individuais pelo menos meses para escalas de tempo ano e não evocam quase nenhuma resposta imune crônica, conforme demonstrado na Figura 9 e Figura 10, respectivamente. Isto representa uma vantagem significativa em comparação com eletrodos de profundidade de Convenção, que geralmente sofrem diminuindo pico amplitudes, sinais instáveis e inflamação crônica ao longo do longo prazo gravação experimentos14, 15. Além disso, a malha eletrônica têm a vantagem que eles podem ser deixados no tecido durante o corte histológico, coloração, e imagem latente, em contraste com sondas convencionais, que são demasiado rígida e, portanto, deve ser removida antes da histologia análises. Daí, malha eletrônica permite a capacidade única de usar a análise imuno-histoquímica para estudar precisamente o ambiente celular em torno de cada local de gravação.
O protocolo apresentado aqui, abre-se emocionante novas oportunidades em neurociência. O método de entrega minimamente invasiva e perfeita integração da malha eletrônica com tecido cerebral minimiza interrupções nos circuitos neurais e evita a resposta imune crônica, que poderia beneficiar a maioria dos tipos de experimentos de gravação neural crônica. A capacidade da malha eletrônica para gravar e rastrear os neurônios único mesmos para longos períodos de tempo especial será de interesse para os investigadores procuram correlacionar atividade cravação de milissegundo-escala com processos mês ano e longo como o envelhecimento, a patogênese da doença do cérebro, ou cérebro desenvolvimento16,18. Além disso, existem oportunidades substanciais para estender e personalizar este protocolo, como a adição de eletrônica ativa ao PCB cabeça-palco para implementar a funcionalidade como digital, multiplexação de8,35, sem fio comunicação,35,36,37e35, co, injetando células-tronco ou polímeros com a malha eletrônica para auxiliar no tecido regeneração18,38, de processamento de sinal 39e incorporando nanofio campo – transistores de efeito (NW-FETs) em malha eletrônica para altamente localizadas e cérebro multifuncional sondas24,29,40,41 ,,42.

O desenvolvimento de ferramentas capazes de mapear o cérebro com resolução de single-neurônio é de importância central de neurociência e Neurologia. Tecnologias não-invasivas para estudos neurais como Eletroencefalografia (EEG), ressonância magnética funcional (fMRI) e magnetoencefalografia (MEG) provaram ser valiosas para correlacionar atividade cerebral com comportamento em seres humanos1, 2, mas eles não têm a resolução spatiotemporal necessária para estudar a estrutura e a dinâmica de redes neurais no seu micrômetro fundamental e milissegundo escalas, respectivamente3,4. Sondas de certa eletrocorticografia (ECoG) e métodos de imagem ópticos usando corantes sensíveis à voltagem conseguiram gravar unitárias cravação atividade na vivo5,6, mas são geralmente eficazes apenas perto do superfície do cérebro, limitando a aplicabilidade a estudos de regiões cerebrais superficial. Em contraste, implantáveis elétricas sondas podem medir single-neurônio eletrofisiologia em movimentando-se livremente animais de praticamente qualquer região do cérebro sem a necessidade de rotulagem fluorescente, tornando-os indispensáveis para a neurociência de sistemas-nível, especialmente como microfabrication técnicas da indústria de semicondutores têm empurrado a quantidade de canais para as centenas e milhares de3,7,8,9. Em virtude desses recursos, implantáveis elétricas sondas já fez muitas contribuições importantes de neurociência e Neurologia, incluindo estudos fundamentais de processamento no sistema visual10, o tratamento de neurológica de informações doenças como a doença de Parkinson,11e a demonstração de interfaces cérebro-máquina (especificas) para próteses avançadas12,13.
Não obstante, instabilidade a longo prazo, que se manifesta como diminuir o pico amplitudes e sinais instáveis em escalas de tempo de semanas a meses14,15 limitou-se a aplicabilidade das sondas implantáveis para o estudo de relativamente curto prazo fenômenos, deixando perguntas tais como desenvolvimento e envelhecimento cerebral em grande parte sem resposta. As limitações na instabilidade a longo prazo são um resultado de uma incompatibilidade entre sondas convencionais e tecido cerebral em tamanho, mecânica e topologia14,15,16,17,18. Em termos de tamanho, enquanto as sinapses neuronais e somata é aproximadamente dezenas de nanômetros a dezenas de micrômetros de diâmetro19, respectivamente, sondas tradicionais muitas vezes são significativamente maiores, no caso de matrizes de microeletrodos de silício > 4 vezes o tamanho de um único neurônio corpo celular7,8. O tamanho relativamente grande de tais sondas pode perturbar a estrutura natural e conectividade de denso tecido neural, assim contribuindo para a resposta imune crônica e perturbando os circuitos neurais sendo estudado. Em termos de propriedades mecânicas, sondas tradicionais são drasticamente mais rígidas do que o tecido neural extremamente macio, na qual eles são implantados; sondas até "flexíveis", feitas a partir de 10-20 µm espessos mantos de poliimida são pelo menos 100.000 vezes mais duras que os de20,de tecido de cérebro21. Esta incompatibilidade na rigidez de flexão faz com que o movimento relativo de cisalhamento entre a sonda e cérebro tecido, levando à unitárias não confiável de rastreamento durante gravações estendidas e induzindo gliose crônica no local do implante. Finalmente, a estrutura topológica de sondas convencionais cérebro necessariamente exclui um volume sólido do tecido. Tal incompatibilidade na topologia interrompe a conectividade dos circuitos neurais, opõe-se a natural distribuição tridimensional (3D) interpenetrated de neurônios, células gliais e os vasos sanguíneos no cérebro tecido22e dificulta o transporte 3D de sinalização moléculas23. Juntas, estas deficiências de sondas convencionais de têm-los feito aquém a compatibilidade a longo prazo, procurada para aplicações clínicas e estudos de neurociência longitudinal a nível de single-neurônio.
Para superar estas deficiências, procuramos borrar a linha entre os sistemas neurais e electrónicos através do desenvolvimento de um novo paradigma de "tecido-como" neurais sondas denominado malha eletrônica16,21,24. Malha eletrônica soluciona os problemas de correspondência acima em tamanho, mecânica e topologia incorporando características (1) estruturais da mesma nanômetros para escala de tamanho micrométrico do tecido neural, (2) mecânicas Propriedades semelhantes do tecido cerebral e (3) um 3D se topologia que é > 90% espaço aberto e, portanto, acomoda interpenetração por neurônios e a difusão de moléculas através do ambiente extracelular. Malha eletrônica sondas podem ser entregues precisamente para regiões específicas do cérebro, através de uma seringa e uma agulha, causando danos mínimos agudo enquanto implantação mesmo em profunda do cérebro regiões21,25. Axônios e soma neuronal têm sido mostrados para interpenetrar a estrutura de sonda de eletrônica de malha 3D aberto dentro pós-injeção de semanas, criando assim uma interface perfeita, livre de gliose entre gravação eletrônica e em torno de tecido de cérebro21 , 26 , 27. estas características únicas permitiram malha eletrônica sondas para estàvel acompanhar atividade cravação de neurônios individuais mesmos ao longo de pelo menos um ano calendário27. Além disso, a fabricação da malha eletrônica baseada em fotolitografia (PL) fornece alta escalabilidade do número de eletrodos que podem ser incorporados, com demonstrada canal conta até 128 eletrodos por sonda usando litografia de máscara de contacto simples 28 e um design de (e/s) de entrada/saída de plug-and-play que permite a rápida conexão elétrica para periféricos eletrônicos sem equipamento especializado29.
Uma ampla gama de estudos pode beneficiar de incorporar protocolos de medição eletrônica de malha. A maioria dos experimentos de gravação intracortical poderiam se beneficiar do procedimento de implantação minimamente invasiva malha electronics através da injeção de seringa, drasticamente reduzida resposta imune pós-implante, e a capacidade de deixar malha eletrônica na tecido durante a subsequente histologia e imunocoloração para análise precisa do ambiente biológico ao redor de cada local de gravação. Experimentos de gravação crônica em particular irão derivar o valor da capacidade única de malha eletrônica para controlar um grande número de neurônios individuais por meses a anos. Esse recurso cria oportunidades para estudos com resolução de single-neurônio que eram anteriormente impraticáveis, tais como estudos de envelhecimento longitudinal de circuitos neurais, investigações do cérebro em desenvolvimento e informações sobre a patogênese da espongiformes transmissíveis16.
Este protocolo, descreveremos todos os passos a chave em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica (ver Figura 1). Etapas descritas incluem a fabricação de malha eletrônica em um possível processo padrão baseado no PL em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica de malha eletrônica na vivo, conexão da malha I/O para interfaces de instrumentação padrão, as sessões de gravação contida ou livremente móveis e corte histológico de tecido cerebral contendo malha eletrônica. Alguns pesquisadores usando malha eletrônica apenas para estudos de histologia não podem exigir conexão elétrica e a gravação, caso em que eles podem pular essas etapas. Depois de familiarizar-se com este protocolo, os investigadores devem ter todo o conhecimento necessário para usar malha eletrônica em suas próprias experiências.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Motorized stereotaxic frame</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MTM-3</td>
			<td>For mouse stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512-channel recording controller</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3004</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2132 amplifier board</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3314</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2000 3-ft ultra thin SPI interface cable</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3213</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-150&#160;STD</td>
			<td>Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafers</td>
			<td>Nova Electronic Materials</td>
			<td></td>
			<td>3&#34; P &#60;100&#62; .001-.005 ohm-cm 356-406&#956;m Thick 
			Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &#38; 
			6,000 A&#176;&#177;5% Wet Thermal Oxide on both sides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks (chrome on soda lime glass)</td>
			<td>Advance Reproductions</td>
			<td></td>
			<td>Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator</td>
			<td>Sharon Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000.5 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 mask aligner</td>
			<td>Karl Suss Microtec AG</td>
			<td></td>
			<td>Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOR3A lift-off resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipley 1805 positive photoresist</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-CD-26 positive photoresist developer</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Reynolds Tech</td>
			<td></td>
			<td>For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ plasma surface treatment system</td>
			<td>AST Products, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover PG</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride solution</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>415-1L</td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36% hydrochloric acid solution</td>
			<td>Kanto Corp.</td>
			<td></td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary needles</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder U-type</td>
			<td>Molecular Devices, LLC</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>NORM-JECT&#174;, Henke Sass Wolf</td>
			<td></td>
			<td>Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene intrademic catheter tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece camera</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>DCC1240C</td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXL-M40 dental drill</td>
			<td>Osada</td>
			<td>3144-830</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 mm drill burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-09</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer 14 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-50</td>
			<td>Used to sterlize surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1950 cryosectioning instrument</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Triton x-100</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Neurofilament</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8135</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>PA516291</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>Molecular weight = 70-150 kDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle end clamp</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>RA180/M</td>
			<td>Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed circuit board (PCB)</td>
			<td>Advanced Circuits</td>
			<td></td>
			<td>Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel standard amplifier connector</td>
			<td>Omnetics Connector Corp.</td>
			<td>A79024-001</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel flat flexible cable (FFC)</td>
			<td>Molex, LLC</td>
			<td>152660339</td>
			<td>Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-ch zero insertion force (ZIF) connector</td>
			<td>Hirose Electric Co., LTD</td>
			<td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology

Sondas de eletrofisiologia do cérebro implantáveis são ferramentas valiosas em neurociência, devido à sua capacidade para gravar atividade neural com alta resolução spatiotemporal de regiões do cérebro superficial e profunda. Seu uso tem sido dificultado, no entanto, incompatibilidades mecânicas e estruturais entre as sondas e cérebro tecido que normalmente leva à micromovimentos e gliose com resultante do sinal instabilidade em experimentos de gravação crônica. Em contraste, após a implantação da eletrônica de malha super flexível através da injeção de seringa, a malha sondas forma uma interface perfeita, livre de gliose com o tecido circundante do cérebro que permite o controle estável de neurônios individuais em pelo menos um ano escala de tempo. Este detalhes de protocolo as etapas em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica, incluindo a fabricação de malha eletrônica em um padrão baseado em fotolitos processo possível em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica em vivo, conexão da malha entrada/saída para interfaces de instrumentação padrão, contido ou sessões de gravação, movimentando-se livremente e histológica de seccionamento do cérebro que contenham tecido malha eletrônica. Representante gravações neurais e histologia dados são apresentados. Os investigadores familiarizados com este protocolo terá o conhecimento necessário para incorporar a malha eletrônica em suas próprias experiências e aproveitar as oportunidades únicas oferecidas pela interface neural estável a longo prazo, tais como estudos de envelhecimento processos, desenvolvimento do cérebro e a patogênese da doença cerebral.

Resultados irão variar com base nas espécies animais em estudo, a região do cérebro específica, o tempo decorrido desde a injeção, a quantidade de agudos danos infligidos durante a injeção e o sucesso da e/s interface de procedimento, entre outros fatores. Atividade de cravação unitárias pode não aparecer até 1 dia (no caso de agulhas de diâmetro interno 150 µm) em 1 semana após as injeção e spike amplitudes podem variar até 4 – 6 semanas. A Figura 9 mostra dados eletrofisiológicos representativos de uma sonda eletrônica de 32 canais malha injetado no hipocampo e córtex somatossensorial primário de um rato masculino adulto de C57BL/6J. Aproximadamente de potenciais de campo local de amplitude de 300-µV (LFPs) foram registrados em todos os 32 canais e atividade de cravação unitárias foi gravada em 26 canais. O LFPs e picos isolados permaneceram semelhantes entre 2 e 4 meses, sugerindo uma interface altamente estável entre gravação eletrônica e neurônios ao longo deste período de tempo prolongado. A Figura 10 mostra resultados representativos de corte histológico e imunocoloração de tecido cerebral contendo malha eletrônica 1 ano após a injeção. Coloração para NeuN, um marcador para somata neural e Neurofilamento, um marcador para axônios neurais, não revela pouca ou nenhuma perda de densidade do tecido no local da injeção, implicando a perfeita interface entre o tecido de malha eletrônica e cérebro. Coloração para GFAP (um marcador para astrócitos) mais revela níveis de perto-fundo de astrócitos em torno de malha eletrônica, indicando que sua presença provoca resposta imune pouco crônica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Figura 1: etapas em uma seringa injetável malha eletrônica experiência. Este protocolo descreve todas as etapas-chave em um experimento de gravação neural roedor típico usando malha eletrônica. Experiências geralmente implica, em ordem de execução, (1) fabricação de malha eletrônica, (2) um carregamento de malha eletrônica em agulhas capilares, (3) estereotáxica injeção de malha eletrônica para o cérebro, I/O (4) elétrica interfaceamento para malha eletrônica, gravações contidas ou livremente móveis (5) e (6) malha/tecido, corte e coloração para a histologia. Em alguns estudos, apenas dados de histologia podem ser desejados, caso em que os passos (4) e (5) pode ser ignorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Figura 2: diagrama esquemático mostrando o processo de fabricação de malha plug-and-play eletrônica na região de dispositivo super flexível (linha superior), haste interconexões (linha média) e região I/O (linha inferior). (A) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-1 para definir o fundo passivating camada de cada sonda electrónica do engranzamento plug-and-play. (B) a padronização com máscara-2 PL, evaporação térmica e decolagem metal definir Au interconexões e almofadas de I/O (ouro). (C) padronização com máscara-3 PL, evaporação por feixe de elétrons e decolagem metal definir eletrodos de Pt (azul). (D) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-4 para definir a camada passivating superior. Aberturas no SU-8 são deixadas em cada eletrodo Pt e almofada I/O. (E) A conclusão de malha sonda eletrônica com caixas tracejadas indicando os locais ampliados no topo, meio e linhas de fundo. Arquivos de projeto Fotomáscara estão disponíveis mediante pedido dos autores ou do local do recurso, meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Figura 3: fotografias e imagens de microscópio ótico de plug-and-play de malha eletrônica. (A) lado a lado imagens de microscópio óptico de uma sonda eletrônica de seringa injetável malha com plug-and-play e/s. A sonda foi fotografada após a conclusão da fabricação etapas na Figura 2 , mas antes do lançamento do substrato Ni-revestida. Caixas tracejadas correspondem da esquerda para a direita para as seções da região de dispositivo super flexível, haste e região I/O ampliada em C, D e E, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. (B) fotografia de uma bolacha de 3 polegadas Si contendo 20 completou malha eletrônica sondas. Barra de escala = 20 mm. (C) imagem de microscópio óptico de 20 µm de diâmetro Pt gravação os eléctrodos na região de dispositivo super flexível. Barra de escala = 100 µm. (D) imagem de microscópio óptico de alta densidade Au interconexões na região do tronco. Cada interligação Au é eletricamente isolada e se conecta a um único eletrodo Pt para um único bloco de I/O. Barra de escala = 100 µm. (E) óptica imagem de microscópio almofadas de I/O. Cada bloco consiste em uma região de malha dobrável e uma região contínua de filme fino localizado na haste. Non-realizando SU-8 fitas conectar as porções de malha das almofadas juntos para ajudar a manter o alinhamento. Barra de escala = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Figura 4: montagem do aparato para a realização de agulhas capilares durante a injeção. (A) fotografia dos componentes do aparelho. Os componentes incluem (1) uma agulha de vidro capilar, (2) um titular da pipeta, (3) um elemento de fixação do parafuso circular para o titular de uma pipeta e (4) uma arruela de cone para o titular de uma pipeta. Itens (2) a (4) são incluídas com a compra de um titular da pipeta. A seta marca a saída do titular da pipeta que deve ser colada fechada com epóxi. (B) fotografia do titular pipeta após a montagem e a inserção de uma agulha de vidro capilar. O epóxi adicionado é visível na saída superior do titular da pipeta (marcado pela seta) e tubo capilar conecta o titular de uma pipeta de uma seringa (não mostrada). (C) fotografia do titular a pipeta e a agulha capilar após a fixação ao quadro estereotáxica com uma pinça de ângulo reto final. Barras de escala são 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Figura 5: carregar da malha eletrônica em agulhas de vidro. (A) ilustração esquemática do processo de carregamento para a eletrônica do engranzamento plug-and-play. Uma agulha de vidro está posicionada perto do fim de I/O de uma sonda eletrônica de malha, enquanto ele está suspenso em solução. O êmbolo da seringa é então manualmente retraído para desenhar a malha eletrônica sonda. Posicionamento ideal é com a região de super flexível dispositivo apenas dentro da extremidade da agulha. Fotografias (B) correspondente a (A) de uma sonda eletrônica de malha sendo carregada em uma agulha de vidro. Escala de barras = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Figura 6: esquemático da estação de cirurgia estereotáxica. Uma armação estereotáxica motorizada (A) com titular da pipeta anexado é usada para posicionar a agulha para a região do cérebro desejado. A posição da agulha e carregado de malha eletrônica são monitorados com uma lente objetiva e anexado a câmera (B) e exibido em um computador (C). Uma bomba de seringa (D) flui precisos volumes de solução salina através da agulha, permitindo a injeção precisa, controlada de malha eletrônica na região do cérebro desejado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Figura 7: I/O Plug-and-play, interfaceando procedimento. (A) An FFC substrato de fixação é fixado com cimento dental adjacente a craniotomia. (B) Plug-and-play malha eletrônica stereotaxically é injetadas na região do cérebro desejado usando o método de FoV. (C), a agulha, com as almofadas de I/O da malha eletrônica sonda ainda está lá dentro, é reposicionado sobre o FFC substrato de fixação. (D) fluxo é retomado através da agulha para ejetar as almofadas de I/O para o FFC substrato de fixação. (E) as almofadas de I/O são dobrados a 90 ° em relação à haste, se desenrolava com a maestro virados para cima e secos no lugar. Substrato (F) o FFC é cortado com uma tesoura para uma linha recta ca. 0,5 mm da borda das almofadas do I/O. Substrato em excesso é cortado para permitir a inserção em um conector ZIF de 32 canais. Almofadas (G) a e/s são inseridas em um conector ZIF de 32 canais montado em um PCB personalizado. O conector ZIF é trancado fechada para fazer contato com as almofadas de I/O. (H), a trava é cimentada fechado, o PCB é invertido para o crânio e o PCB é fixado com cimento dental. (eu) o PCB forma um headstage compacto com um conector padrão de amplificador para interfaceamento fácil durante as sessões de gravação. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Figura 8: gravações comedidas e livremente movente. (A) fotografia de um rato C57BL/6J masculino em uma retenção durante uma sessão de gravação. Um pré-amplificador de 32 canais PCB foi inserido no conector amplificador padrão. (B) fotografia do mouse mesmo com pré-amplificador de 32 canais PCB durante um experimento de gravação livremente em movimento. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Figura 9: resultados representativos de gravação neural. (A) representante LFP mapas de calor de 32 canais de malha sondas eletrônica injetadas o rato hipocampo e córtex somatossensorial. Dados foram gravados enquanto o mouse livremente explorado sua gaiola em 2 meses (topo) e pós-injeção de 4 meses (parte inferior). Amplitude LFP é codificados por cores de acordo com a barra de cores à direita. Vestígios de filtrado de passa-alta (preto) mostrando atividade cravação são sobrepostos no espectrograma para cada um dos 32 canais. (B) picos isolados após a classificação dos dados plotados no (A). Atividade de cravação unitárias foi detectada no 26 da 32 canais de ambos os 2 meses pós-injeção (topo) e injeção de pós 4 meses (parte inferior). Os números acima de cada cluster de picos correspondem aos números de canal no (A). Esta figura foi modificada de Fu, et al 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Figura 10: resultados representativos histologia. (A) esquema ilustrando a orientação da malha eletrônica dentro horizontal (painel central) e sagital fatias de cérebro (painel inferior). (B) imagem de microscópio de fluorescência de uma fatia de espessura cortical cerebral de 10 µm um ano após a injeção de uma sonda eletrônica de malha de 16 canais. A fatia tem sido immunostained por NeuN (verde). (C) a mesma fatia do cérebro immunostained para Neurofilamento (vermelho). (D) o mesmo cérebro fatia immunostained para GFAP (ciano). (E), A imagem composta (B) a (D) mostrando o malha eletrônica/tecido interface com rotulado NeuN (verde), Neurofilamento (vermelho), GFAP (ciano) e malha eletrônica (azul). Barras de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada em Fu et al . 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Video 1: repetiu o carregamento e injeção de malha eletrônica na solução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

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