Name: syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00
Duration: 9 min 58 s
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C.M.L. reconoce apoyo de esta obra por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-14-1-0136) y un premio acelerador ingeniería y Ciencias de física de la Universidad de Harvard () Premio pionero nacional institutos de salud del Director 1DP1EB025835-01). T.G.S. agradece apoyo por el Departamento de defensa (DoD) a través del programa nacional de defensa de ciencia e Ingeniería Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconoce apoyo de beca de la American Heart Association (16POST27250219) y el camino al premio independencia (padre K99/R00) del Instituto Nacional sobre el envejecimiento de los institutos nacionales de salud. Este trabajo fue realizado en parte en el centro de la Universidad de Harvard para sistemas a nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo NSF CEC Award no. 1541959.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Todos los pasos en la fabricación y el uso de la malla electrónica son importantes, pero algunos son particularmente importantes. Antes de soltar la malla electrónica de su oblea, es esencial para la oxidación de la superficie para hacer las mallas fácilmente suspendidas en solución acuosa (paso 1.6.1). Si se omite este paso, las mallas generalmente flotan en la superficie del agua, que dificulta la carga en las agujas, y si pueden ser cargados, a menudo pegarse a las paredes de las agujas de vidrio, que requieren grandes volúmenes (> 100 μL) para la inyección. Falta para oxidar la superficie antes de lanzamiento, por lo tanto, normalmente significa que no se puede utilizar las mallas y la fabricación deben volver a realizarse desde el principio. Otro paso fundamental es doblar la malla electrónica "tallo" a ~ 90° durante la entrada-salida interfaz (paso 4.3). Si el ángulo es menor que 90°, entonces todos 32 cojines de I/O no cabrán en el conector ZIF; Algunos tendrán que cortar el extremo para permitir la inserción, reducción del número de electrodos conectados. El proceso también debe hacer suavemente para evitar que se rompa el tallo.
El diseño de la malla electrónica puede modificar para requisitos particulares para diversas aplicaciones modificando los photomasks y usando el mismo procedimiento de fabricación que se indica en la figura 2. Por ejemplo, mientras que la malla electrónica las puntas de prueba utilizados para grabar los datos en la figura 9 fueron diseñados para tener 32 electrodos de grabación abarcan el ratón hipocampo y la corteza somatosensorial primaria, puede ser la colocación de electrodos dentro de la malla ultraflexible seleccionado a prácticamente cualquier región o regiones del cerebro, o más electrodos para la estimulación pueden ser incorporado27. El mismo procedimiento de fabricación y estructura de la malla básica se mantienen, pero la colocación del electrodo y el diseño se ajustan a las necesidades del estudio. Los investigadores deben tenga cuidado, sin embargo y siempre prueba que diseños modificados se pueden inyectar fácilmente a través de las agujas previstas. Pequeños cambios en la flexión mecánica de la malla electrónica puede tener efectos sustanciales sobre la inyectabilidad. Un ejemplo de ello es que un ángulo de 45° entre cintas de SU-8 transversales y longitudinales produce una sonda electrónica de malla que suelen inyectarse pero uno que cae y se obstruyen con agujas21produce un ángulo de 90°.
Medición de la impedancia de los electrodos de registro es útil para solucionar problemas. Un electrodo de Pt de 20 μm de diámetro circular debe tener un magnitud de impedancia cerca de 1 MΩ cuando se mide a una frecuencia de 1 kHz en vivo o en 1 x PBS29. Una impedancia significativamente más grande que esto implica que el electrodo no es expuesto, como puede ocurrir si se contamina con photoresist residuo o no eléctricamente conectado. Este último puede ocurrir si, por ejemplo, hay polvo en la máscara de la foto durante la PL que interconecta resultados en una desconexión en la UA, o si uno de los botones de I/O de malla no es contactado por los pines del conector ZIF en interfaces de I/O. Una magnitud de la impedancia aproximadamente la mitad del valor esperado indica que el canal puede estar en corto circuito a la adyacente, creando un circuito de dos impedancias de electrodos en paralelo. Los valores de la impedancia medida actúan como guía durante la solución de problemas; combinado con microscopía óptica de las sondas de electrónica de red, la fuente del problema puede generalmente ser identificada y corregida por consiguiente en la siguiente fabricación ejecutar o intento de interconexión de I/O.
El uso de la jeringa inyectable malla electrónica para estudios agudos se limita en que actividad spiking unitarios generalmente no se observa hasta 1 semana post inyección27, aunque trabajos recientes (inédito) muestran que este problema es fácilmente vencido. Determinantes del tiempo requerido para ver actividad de clavar la malla de diseño, el volumen de líquido inyectado en el cerebro junto con malla electrónica y el diámetro de la aguja utilizada para la inyección, como éstos afectan el grado de daño de tejido durante el inyección y la tasa de curación. Volúmenes de inyección grandes pueden ser necesarios si la malla electrónica no se trata con plasma de oxígeno antes de la liberación en Ni grabador; es decir, si la malla no es hidrofílica, puede adherirse a la aguja de vidrio. En ocasiones, las mallas tienen defectos que llevan a la flexión mecánica que los hacen difíciles de inyectar. Durante la carga de la malla electrónica, es importante comprobar que mallas se desplazan fácilmente y sin problemas dentro de la aguja (como se muestra en el Video complementario 1). Si no es así, puede usarse una sonda electrónica de malla diferentes. Con los volúmenes de inyección ideal de 10-50 μL por 4 mm de longitud de malla inyectado se logrará mejores resultados para la perfecta interconexión neuronal. Los resultados más recientes con fina malla electrónica sondas inyección o menor diámetro capilar las agujas (tan pequeñas como 150 μm de diámetro interior, diámetro exterior de 250 μm) muestran que clavar la unidad solo puede ser observada desde poco después de la inyección (medidas agudas) a través del tiempo. Archivos de diseño de máscara para estas estructuras de malla más finas están disponibles por solicitud o desde la Web de recursos, meshelectronics.org. Se estima el rendimiento global de nuestros vivo malla inyección procedimientos utilizando agujas de (diámetro exterior 650 μm) de diámetro interno de μm 400 a 70%, aunque el rendimiento es más cercano a 80-90% de nuestros trabajos más recientes con diámetro interior de 150 μm (250 μm de diámetro exterior ) agujas. Las razones más comunes para el fracaso son (1) que la malla no inyectar suavemente, dando por resultado edema cerebral desde los volúmenes de inyección inesperadamente grande en el cerebro, (2) malla roturas durante la manipulación manual requerida en la entrada-salida interfaz de procedimiento y (3) el sangrar de dañar un vaso sanguíneo durante la inyección. Dañar un vaso sanguíneo durante la inyección es raro (la causa de menos del 10% de fracasos) y podría reducirse aún más mediante cirugía guiada por imágenes. Además tenemos en cuenta que el daño de los vasos sanguíneos es una limitación común de todos los procedimientos que implica la penetración del tejido del cerebro, incluyendo la inyección de partículas virales para la transfección, implantación de sondas cerebro rígido y la inyección de la malla electrónica.
Malla electrónica son capaces de estable grabar de y seguimiento de las mismas neuronas individuales en menos meses a año plazos y no evocar casi ninguna respuesta inmune crónica, como se muestra en la figura 9 y figura 10, respectivamente. Esto representa una ventaja significativa en comparación con electrodos de profundidad de Convención, que comúnmente sufren de disminución de las amplitudes de pico, señales inestables e inflamación crónica en el transcurso de grabación experimentos14, a largo plazo 15. Adicionalmente, la malla electrónica tienen la ventaja que puede dejar en el tejido durante el corte histológico, coloración, y la proyección de imagen, en contraste con las sondas convencionales, que son demasiado rígidas y por lo tanto deben ser removida antes de histología Análisis. Por lo tanto, malla electrónica permite la capacidad única de usar el análisis de immunohistochemical para estudiar precisamente el entorno celular que rodea cada sitio de la grabación.
El protocolo presentado aquí se abre para arriba emocionantes nuevas oportunidades en la neurociencia. El método mínimamente invasivo y la integración de la electrónica de malla con tejido cerebral reduce al mínimo la interrupción de circuitos neuronales y evita respuesta inmune crónica, que podría beneficiar a casi todos los tipos de experimentos de grabación neuronal crónica. La capacidad de la malla electrónica para registrar y rastrear las mismas neuronas solo por largos períodos de tiempo sobre todo será de interés para los investigadores buscando correlacionar actividad spiking milisegundo-escala con procesos de meses a años de duración como el envejecimiento, la patogenia de la enfermedad cerebral, o cerebro desarrollo16,18. Además, existen importantes oportunidades para ampliar y personalizar este protocolo, como la adición de una electrónica activa al PCB cabeza-escenario para implementar la funcionalidad como digital multiplexado8,35, inalámbrico comunicación35,36,37y35, conjuntamente inyectar las células madre o polímeros con la malla electrónica ayuda en tejido regeneración18,38, de procesamiento de señales 39e incorporando nanocable transistores efecto de campo (NW-FETs) en malla electrónica para muy localizada y cerebro multifuncional sondas24,29,40,41 ,42.

El desarrollo de herramientas capaces de cartografiar el cerebro con una resolución de la solo-neurona es de importancia central a la neurociencia y Neurología. Tecnologías no invasivas estudios neuronales tales como electroencefalografía (EEG) y magnetoencefalografía (MEG) la proyección de imagen de resonancia magnética funcional (fMRI) han demostrado ser valiosos para correlacionar actividad cerebral con el comportamiento de los seres humanos1, 2, pero falta la resolución espacio-temporal necesaria para estudiar la estructura y dinámica de redes neuronales en sus fundamental micrómetro y milisegundo escalas, respectivamente3,4. Cierta electrocorticography (ECoG) sondas y métodos de proyección de imagen ópticos con colorantes sensibles a la tensión han logrado en la grabación de una sola unidad spiking actividad en vivo5,6, pero son generalmente eficaces sólo cerca de la superficie del cerebro, limita la aplicabilidad a los estudios de regiones superficiales del cerebro. Por el contrario, sondeos eléctricos implantables pueden medir solo-neurona electrofisiología libremente pasar animales de prácticamente cualquier región del cerebro sin necesidad de etiquetado fluorescente, haciendo imprescindible a nivel de sistemas de neurociencia, sobre todo como técnicas de microfabricación de la industria de semiconductores han llevado cantidad de canales en los cientos y miles3,7,8,9. En virtud de estas capacidades, sondeos eléctricos implantables han hecho muchas contribuciones importantes a la neurociencia y Neurología, incluyendo estudios fundamentales de procesamiento en el sistema visual10, el tratamiento neurológico de la información trastornos como la enfermedad de Parkinson11y la demostración de las interfaces cerebro-máquina (IMC) para prótesis avanzada12,13.
Sin embargo, la inestabilidad a largo plazo que se manifiesta como disminución de las amplitudes de pico y señales inestables en escalas de tiempo de semanas a meses14,15 ha limitado la aplicabilidad de sondas implantables para el estudio de relativamente a corto plazo fenómenos, dejando cuestiones como el desarrollo y el envejecimiento del cerebro en gran medida sin respuesta. Las limitaciones en la inestabilidad a largo plazo son el resultado de un desajuste entre las sondas convencionales y tejido cerebral en tamaño, mecánica y topología14,15,16,17,18. En términos de tamaño, mientras que las sinapsis neuronales y Somas son aproximadamente de decenas de nanómetros a decenas de micrómetros en diámetro19, respectivamente, las puntas de prueba tradicionales son a menudo significativamente mayores, en el caso de arreglos de microelectrodos de silicio > 4 veces el tamaño de una sola neurona cuerpo celular7,8. El relativamente gran tamaño de estas puntas de prueba puede afectar la estructura y Conectividad del denso tejido neural, así contribuyendo a la respuesta inmune crónica y perturbando los circuitos neuronales que están estudiando. En cuanto a propiedades mecánicas, las puntas de prueba tradicionales son drásticamente más rígidos que el tejido neural muy suave en el que se implantan; incluso «flexible» de 10 – 20 μm espesor láminas de poliimida son al menos 100.000 veces más rígido que el cerebro tejido20,21. Este desajuste en la rigidez de flexión hace esquileo relativo movimiento entre la sonda y el cerebro tejido, llevando a poco fiables de una sola unidad seguimiento durante grabaciones extendidas e induciendo crónica gliosis en el sitio de implantación. Por último, la estructura topológica de las sondas convencionales cerebro excluye necesariamente un volumen sólido del tejido. Tal desajuste en topología interrumpe la conectividad de los circuitos neuronales, impide la distribución interpenetrada (3D) tridimensional natural de las neuronas, células gliales y vasos sanguíneos dentro del tejido de cerebro22y dificulta el transporte 3D de señalización de moléculas23. Juntos, estos defectos de las sondas convencionales han hecho están destituidos de la compatibilidad a largo plazo para aplicaciones clínicas y los estudios de Neurociencia longitudinal en el plano de la solo-neurona.
Para superar estas deficiencias, se intentó difuminar la línea entre los sistemas neuronales y electrónicas mediante el desarrollo de un nuevo paradigma de "tejido-como" sondas neuronales denominado malla electrónica16,21,24. Malla electrónica aborda los problemas que arriba en tamaño, mecánica y topología incorporando características (1) estructurales de la misma nanómetro a escala de tamaño micrométrico de tejido neural, (2) mecánicas similares a las de tejido cerebral y (3) 3D topología de macroporoso que es > 90% espacio abierto y así acomoda la interpenetración de las neuronas y la difusión de moléculas a través del ambiente extracelular. Malla electrónica sondas pueden entregarse precisamente a las regiones específicas del cerebro a través de una jeringa y una aguja, que causa mínimo daño agudo al implantar incluso en regiones de cerebro profundo21,25. Axones y soma neuronal se ha demostrado que se interpenetran la estructura de punta de prueba electrónica abierta con malla 3D dentro de semanas después de la inyección, creando una interfaz transparente, libre de gliosis entre grabación electrónica y alrededor del tejido de cerebro21 , 26 , 27. estas características únicas han permitido malla electrónica sondas rastrear estable actividad clavaba de las mismas neuronas individuales en al menos un año de plazo27. Por otra parte, la fabricación de la electrónica de malla basada en Fotolitografía (PL) proporciona alta escalabilidad del número de electrodos que pueden ser incorporados, con canal demostrado cuenta hasta 128 electrodos por sonda mediante litografía simple mascarilla contacto 28 y un diseño de (E/S) de entrada/salida de plug-and-play que permite la rápida conexión eléctrica electrónica periférica sin equipo especializado29.
Una amplia gama de estudios puede beneficiarse incorporando malla electrónica en protocolos de medición. Mayoría de grabación intracortical los experimentos podría beneficiarse del procedimiento de implantación mínimamente invasiva malla electrónica vía la inyección de la jeringa, la respuesta inmune drásticamente reducida después de la implantación, y la capacidad de dejar de malla electrónica en la tejido durante la histología subsecuente y el immunostaining para el análisis preciso del ambiente biológico alrededor de cada sitio de grabación. Experimentos de grabación crónica en particular serán obtener el valor de la capacidad única de la malla electrónica para seguimiento de gran número de neuronas individuales por meses o años. Esta capacidad crea oportunidades de estudios con la resolución de la solo-neurona que fueron previamente impráctico, tales como estudio longitudinal de envejecimiento de circuitos neuronales, las investigaciones del cerebro en desarrollo y consultas en la patogenesia de encefalopatías transmisibles16.
En este protocolo, describimos todos los pasos de la llave en un experimento de grabación neuronal de ratón típico usando jeringa inyectable malla electrónica (véase figura 1). Pasos descritos incluyen la fabricación de la malla electrónica en un posible proceso de PL estándar en muchas universidades, cargar malla electrónica en agujas capilares estándar, inyección estereotáctica de malla electrónica en vivo, respecto de la interfaces estándar de instrumentación, las sesiones de grabación restringida o libremente móvil y secciones histológicas del tejido de cerebro que contienen malla electrónica del acoplamiento I/O. Algunos investigadores usando malla electrónica sólo para estudios de histología no requieran interfaces eléctricos y de grabación, en cuyo caso pueden omitir estos pasos. Después de familiarizarse con este protocolo, los investigadores deben tener todos los conocimientos necesarios para utilizar malla electrónica en sus propios experimentos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Motorized stereotaxic frame</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MTM-3</td>
			<td>For mouse stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512-channel recording controller</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3004</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2132 amplifier board</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3314</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHD2000 3-ft ultra thin SPI interface cable</td>
			<td>Intan Technologies</td>
			<td>C3213</td>
			<td>A component of the neural recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-150&#160;STD</td>
			<td>Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafers</td>
			<td>Nova Electronic Materials</td>
			<td></td>
			<td>3&#34; P &#60;100&#62; .001-.005 ohm-cm 356-406&#956;m Thick 
			Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &#38; 
			6,000 A&#176;&#177;5% Wet Thermal Oxide on both sides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks (chrome on soda lime glass)</td>
			<td>Advance Reproductions</td>
			<td></td>
			<td>Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator</td>
			<td>Sharon Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000.5 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 mask aligner</td>
			<td>Karl Suss Microtec AG</td>
			<td></td>
			<td>Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOR3A lift-off resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipley 1805 positive photoresist</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-CD-26 positive photoresist developer</td>
			<td>Microposit, The Dow Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td>To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Reynolds Tech</td>
			<td></td>
			<td>For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ plasma surface treatment system</td>
			<td>AST Products, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td>For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover PG</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride solution</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>415-1L</td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36% hydrochloric acid solution</td>
			<td>Kanto Corp.</td>
			<td></td>
			<td>A component of Ni etching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary needles</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder U-type</td>
			<td>Molecular Devices, LLC</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>NORM-JECT&#174;, Henke Sass Wolf</td>
			<td></td>
			<td>Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene intrademic catheter tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td>Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece camera</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>DCC1240C</td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to view mesh electronics within capillary needles during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXL-M40 dental drill</td>
			<td>Osada</td>
			<td>3144-830</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 mm drill burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-09</td>
			<td>For drilling the craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer 14 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-50</td>
			<td>Used to sterlize surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1950 cryosectioning instrument</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Triton x-100</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Neurofilament</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8135</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>PA516291</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>Molecular weight = 70-150 kDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle end clamp</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>RA180/M</td>
			<td>Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed circuit board (PCB)</td>
			<td>Advanced Circuits</td>
			<td></td>
			<td>Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel standard amplifier connector</td>
			<td>Omnetics Connector Corp.</td>
			<td>A79024-001</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel flat flexible cable (FFC)</td>
			<td>Molex, LLC</td>
			<td>152660339</td>
			<td>Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-ch zero insertion force (ZIF) connector</td>
			<td>Hirose Electric Co., LTD</td>
			<td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td>
			<td>Component assembled onto the PCB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

syringe-injectable mesh electronics for stable chronic rodent electrophysiology

Puntas de prueba de electrofisiología cerebral implantable son herramientas valiosas en Neurociencia debido a su capacidad para grabar actividad neuronal con alta resolución espaciotemporal de regiones someras y profundas del cerebro. Su uso ha sido obstaculizado, sin embargo, por desajustes mecánicos y estructurales entre las sondas y cerebro tejido que comúnmente conducen a micromotion y gliosis con que señal de inestabilidad en los experimentos de grabación crónica. En contraste, después de la implantación de la ultraflexible malla electrónica vía la inyección de la jeringa, la malla de sondeos forma una interfaz transparente, libre de gliosis con el tejido de cerebro circundante que permite seguimiento estable de neuronas individuales en al menos un año escala de tiempo. Este detalles de protocolo los pasos clave en un experimento de grabación neuronal de ratón típico usando jeringa inyectable malla electrónica, incluyendo la fabricación de la malla electrónica en un estándar Fotolitografía proceso posible en muchas universidades, carga malla electrónica en agujas capilares estándar, inyección estereotáctica en vivo, conexión de la malla de entrada/salida para interfaces de instrumentación estándar, refrenados o mover libremente las sesiones de grabación e histológica de secciones del cerebro que contiene el tejido de malla electrónica. Se presentan grabaciones representativas de nervios y datos de la histología. Investigadores familiarizados con este protocolo tendrá los conocimientos necesarios para incorporar malla electrónica en sus propios experimentos y tomar ventaja de las oportunidades únicas que ofrece interconexión neuronal estable a largo plazo, tales como estudios de envejecimiento procesos, el desarrollo del cerebro y la patogenesia de la enfermedad cerebral.

Resultados variará según la especie animal en el estudio, la región cerebral específica, el tiempo transcurrido desde la inyección, la cantidad de daño agudo durante la inyección y el éxito de la entrada-salida interfaz de procedimiento, entre otros factores. Actividad spiking unitarios puede no aparecer hasta 1 día (en el caso de 150 μm agujas de diámetro interno) para 1 semana después de que las amplitudes de inyección y spike pueden variar hasta 4 – 6 semanas. La figura 9 muestra datos electrofisiológicos representativos de una punta de prueba de 32 canales malla electrónica inyectada en el hipocampo y la corteza somatosensorial primaria de un ratón C57BL/6J macho adulto. Aproximadamente 300 μV amplitud campo locales potenciales (LFPs) fueron registrados en todos los 32 canales y actividad clavaba una sola unidad se registró en 26 canales. El LFPs y picos aislados seguían siendo similares entre 2 y 4 meses, lo que sugiere una interfaz altamente estable entre grabación electrónica y las neuronas en este período de tiempo prolongado. La figura 10 muestra resultados representativos de secciones histológicas y el immunostaining del tejido de cerebro que contienen malla electrónica 1 año después de la inyección. Coloración para NeuN, marcador de Somas neuronales y neurofilament, un marcador para axones neuronales, no revela poco o ninguna pérdida de densidad del tejido en el sitio de inyección, implicando inconsútil interfaz entre el tejido de malla electrónica y el cerebro. Coloración para GFAP (marcador de astrocitos) más revela niveles de cerca de fondo de astrocitos en malla electrónica, indicando que su presencia provoca respuesta inmune poco crónica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Figura 1: pasos en una jeringa inyectable malla electrónica experimento. Este protocolo describe todos los pasos claves en un experimento típico roedor grabación neuronales usando malla electrónica. Experimentos implican generalmente, en orden de ejecución, (1) fabricación de la malla electrónica, (2) carga de la malla electrónica en agujas capilares, inyección (3) estereotáxicas de malla electrónica en el cerebro, (4) eléctricos I/O interface para malla electrónica, grabaciones contenidas o libre movimiento (5) y (6) malla tejido seccionado y tinción para histología. En algunos estudios, sólo los datos de la histología pueden desear, en cuyo caso puede omitirse pasos (4) y (5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Figura 2: esquema que representa el procedimiento de fabricación de electrónica de red plug-and-play en la región de dispositivo ultraflexible (fila superior), madre interconecta la región (fila media) y región de I/O (fila inferior). (A) SU-8 photoresist negativo (rojo) es modelado con máscara de PL-1 para definir el fondo pasivado de capa de cada sonda electrónica de acoplamiento plug-and-play. (B) dibujo con máscara-2 PL, evaporación térmica y despegue metal definir Au interconecta y I/O (oro). (C) dibujo con máscara-3 PL, evaporación de viga del electrón y despegue metal definir electrodos de Pt (azul). (D) SU-8 photoresist negativo (rojo) es modelado con máscara de PL-4 para definir la capa de pasivación superior. Las aberturas en el SU-8 quedan en cada electrodo de Pt y la almohadilla de I/O. (E) A terminado malla sonda electrónica con cajas discontinuas que indica las posiciones ampliadas en la parte superior, media y filas de fondo. Archivos de diseño de fotomáscara están disponibles por petición de los autores o desde el sitio de recursos, meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Figura 3: fotografías e imágenes de microscopio óptico de plug-and-play de malla electrónica. (A) imágenes de microscopio óptico de una sonda electrónica de malla jeringa inyectable con la entrada-salida del plug-and-play de baldosas. La sonda era reflejada después de la finalización de la fabricación los pasos en la figura 2 pero antes del lanzamiento del substrato Ni revestido. Cajas discontinuas corresponden de izquierda a derecha a las secciones de la región de dispositivo ultraflexible, vástago, I/O región y magnificado en C, D y E, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. (B) fotografía de una oblea de Si de 3 pulgadas que contiene 20 terminado malla electrónica sondas. Barra de escala = 20 mm. (C) imagen de microscopio óptico de electrodos grabación Pt 20 μm de diámetro en la región de dispositivo ultraflexible. Barra de escala = 100 μm. (D) imagen de microscopio óptico de alta densidad Au interconecta en la región del tallo. Cada interconexión de Au es aislada eléctricamente y conecta un solo electrodo de Pt con un solo botón I/O. Barra de escala = 100 μm. (E) óptico microscopio imagen de cojines I/O. Cada almohadilla se compone de una región de malla plegable y una región de película delgada continua ubicado en el tallo. Realización de no SU-8 cintas conectan las partes de acoplamiento de las pastillas para ayudar a mantener la alineación. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Figura 4: montaje del aparato para sostener agujas capilares durante la inyección. (A) fotografía de los componentes del aparato. Los componentes incluyen (1) una aguja capilar de vidrio, (2) un soporte de pipeta, (3) un sujetador de tornillo circular portador de la pipeta y (4) una arandela conica para el titular de la pipeta. Artículos (2) a (4) se incluyen con la compra de un soporte de pipeta. La flecha marca la salida del titular de pipeta que se pega con epoxi. (B) fotografía del titular de la pipeta después de Asamblea y la inserción de una aguja capilar de vidrio. El agregado de epoxy es visible en la salida superior del porta pipeta (señalada con flecha) y tubo capilar conecta el soporte de la pipeta con una jeringa (no mostrada). (C) fotografía del titular de la pipeta y la aguja capilar después de la fijación al bastidor estereotáxicas con una abrazadera de ángulo recto final. Barras de escala son 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Figura 5: carga de la malla electrónica en agujas de cristal. (A) Ilustración esquemática del procedimiento de carga de plug-and-play malla electrónica. Una aguja de vidrio se coloca cerca del extremo de I/O de una sonda electrónica de acoplamiento mientras que está suspendido en la solución. Émbolo de la jeringa luego se retrae manualmente para dibujar en la punta de prueba electrónica de malla. Posición ideal es con la región ultraflexible dispositivo justo en el extremo de la aguja. (B) fotografías correspondientes a (A) de una sonda electrónica de malla se cargue en una aguja de vidrio. Barras de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Figura 6: esquema de la estación de cirugía estereotáctica. Un armazón estereotáxicas motorizado (A) con soporte para pipeta adjunta se utiliza para colocar la aguja en la región del cerebro deseada. La posición de la aguja y el acoplamiento de carga electrónica son monitoreados con un objetivo y adjunto cámara (B) y en un ordenador (C). Una bomba de jeringa (D) fluye precisa volúmenes de solución salina a través de la aguja, permitiendo para la inyección precisa y controlada de la malla electrónica en la región del cerebro deseado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Figura 7: Plug-and-play I/O interface procedimiento. (A) FFC un sustrato de fijación se asegura con cemento dental adyacente a la craneotomía. (B) Plug-and-play malla electrónica stereotaxically se inyecta en la región del cerebro deseada utilizando el método de campo de visión. (C) la aguja, con las almohadillas de I/O de la malla electrónica dentro de la punta de prueba, es reposicionado sobre FFC sustrato de fijación. (D) flujo se reasume a través de la aguja para extraer las pastillas de I/O en el FFC sustrato de fijación. (E) las almohadillas de I/O están doblados a 90 ° en relación con la madre, se desarrolló con la dirección hacia arriba y secar en lugar. Sustrato (F) la FFC se recorta con unas tijeras a una línea recta aprox. 0,5 mm desde el borde de las pastillas de I/O. Substrato sobrante se corta para permitir la inserción de un conector ZIF de 32 canales. (G) la entrada-salida pastillas se introducen en un conector ZIF de 32 canales montado sobre un PCB personalizado. El conector ZIF esté bien cerrada para hacer contacto con las almohadillas de I/O. Se cementa (H) el pestillo cerrado, la placa se voltea en el cráneo, y el PCB se fija en su lugar con cemento dental. () El PCB forma un headstage compacto con un conector de amplificador estándar para interfaces de fácil durante las sesiones de grabación. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Figura 8: grabaciones contenidas y libremente móviles. (A) fotografía del macho ratón C57BL/6J un limitador durante una sesión de grabación. Un PCB de preamplificador de canal 32 se ha insertado en el conector del amplificador estándar. (B) fotografía del mismo ratón con 32 canales preamplificador PCB durante un experimento de grabación libremente móviles. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Figura 9: grabación neuronales representativas resultados. (A) representante LFP mapas de calor de 32 canales de malla de puntas de prueba electrónica inyectadas en el ratón hipocampo y la corteza somatosensorial. Los datos fueron registrados mientras que el ratón explora libremente su jaula en 2 meses (arriba) y después de la inyección 4 meses (parte inferior). Amplitud de la LFP es codificados por colores según la barra de color a la derecha. High-pass filtrados rastros (negro) que muestra actividad spiking son overlaid en el espectrograma para cada uno de los 32 canales. (B) espigas aisladas después de ordenar los datos trazados en (A). Se detectó actividad clavaba una sola unidad en 26 de los 32 canales ambos 2 meses posterior a la inyección (arriba) y 4 meses posterior a la inyección (parte inferior). Los números sobre cada racimo de picos corresponden a los números de canal en (A). Esta figura ha sido modificada de Fu, et al. 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Figura 10: resultados de histología representativa. (A) diagrama esquemático que ilustra la orientación de la malla electrónica en horizontal (panel central) y sagital rebanadas de cerebro (panel inferior). (B) imagen de microscopio de fluorescencia de un trozo de cerebro cortical gruesa de 10 μm un año después de la inyección de una sonda electrónica de malla de 16 canales. El segmento ha sido immunostained para NeuN (verde). (C) el mismo segmento de cerebro immunostained para neurofilamentos (rojo). (D) el mismo cerebro rebanada immunostained para GFAP (cian). (E) A imagen compuesta (b) a (D) que muestra el tejido malla electrónica interfaz con etiquetado NeuN (verde), neurofilamentos (rojo), GFAP (cian) y malla electrónica (azul). Barras de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de Fu et al. 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1 Video complementario: repetida carga e inyección de malla electrónica en solución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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