Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

ويستند هذا المنشور إلى العمل المدعوم من "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت "رقم المنحة"  تشي 1708237.

<ol>
	<li>Hochuli, E., Bannwarth, W., D&#246;beli, H., Gentz, R., St&#252;ber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Approach+to+Facilitate+Purification+of+Recombinant+Proteins+with+a+Novel+Metal+Chelate+Adsorbent.">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li><li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization.">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Biochemistry. , (1999).</li><li>Boyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).</li><li>le Maire, M., Chabaud, R., Herv&#233;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).</li><li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).</li><li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+chromatography+of+lactate+dehydrogenase:+An+experiment+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).</li><li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+milk+whey+&#945;-lactalbumin+by+immobilized+metal-ion+affinity+chromatography.">Purification of milk whey &#945;-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).</li><li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+mutation+to+protein+characterization.">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li><li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students:+An+illustration+of+protein+expression+and+purification*.">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li><li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li><li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education.">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li><li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protein+chemistry+laboratory.">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li><li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi.">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li><li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+writing-intensive,+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates.">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li><li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization:+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase.">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Known+structure,+unknown+function:+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course.">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li><li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes:+Use+of+Recombinant+Protein+Expression+and+Affinity+Tags+to+Aid+Identification+of+Native+Metal+Ion+Cofactors.">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry &amp; Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li><li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes.">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li><li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallo-Enzymes+and+Metallo-Proteins,+Chemistry+of.">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li><li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins+Using+the+pET+System.">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradford+Protein+Assay.">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Quantitation.">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li><li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li><li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+overexpression,+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2,3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum.">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li><li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li><li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis:+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition.">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li><li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification+and+properties+of+2,3-dihydroxyphenylpropionate+1,2-dioxygenase+from+Escherichiacoli.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li><li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2,3-Dihydroxyphenylpropionate+1,2-Dioxygenase+(MhpB).">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li><li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246,+His-199,+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2,3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1.">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li><li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC,+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase.">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li><li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

الكتاب قد لا الكشف.

بينما أصبحت في كل مكان تقريبا في الأدب البيوكيميائية3،4،5، تطبيقات ايماك لتنقية إنزيم إضافة العلامات بوليهيستيديني للبروتينات المؤتلف وتنقية واسطة ايماك التدريس مختبر تبقى متفرق في الكيمياء الحيوية، وأساليب المنشورة لا نعتبر دائماً القيود المفروضة على الموارد التدريس مختبر20. وعلاوة على ذلك، استخدام ايماك في مختبر التدريس الأكثر فعالية عندما يقترن بتجارب تقييم النشاط والنقاء، مما يجعل ايماك تنقية إنزيم نشاط تعليمي مثالي. من أجل توسيع نطاق تطبيق ايماك لتنقية الإنزيمات، بما في ذلك ميتالوينزيميس، في مختبر التدريس، هناك حاجة إلى أساليب وموثوقة وغير مكلفة. في هذا البروتوكول، ونظهر benchtop ايماك استخدام اللوازم المختبرية متوفرة بسهولة وغير مكلفة، بينما أيضا على معالجة أوجه القصور في تطبيق ايماك ميتالوبروتينس22، بإعادة تشكيل الحديد التابعة متالونزيمي، ديوكسيجيناسي لدوبا، وظيفة تنقية. استخدام الكواشف والمواد المذكورة، فإننا نقدر تكلفة المواد الاستهلاكية لثماني مجموعات طلابية من بين 500-600 دولار كل فصل دراسي لتشغيل هذا البروتوكول، بما في ذلك تحليل الخطوات المبينة في الشكل 1 و الشكل 2.
نظراً للسهولة التي Fe2 + يمكن أن ننأى عن الأحماض الأمينية يغاندس24 وأكسدة السطحية Fe2 + س2 إلى Fe3 +، إعادة تشكيل غير الهيم، الحديد الثنائي من الأحماض الأمينية-بالكلاب في متالونزيمي المؤتلف عنصر نموذجي لتنقية الإنزيم. عندما يتم استخدام الفصل اللوني الكلاسيكي، فمن الممكن تجنب الخسارة الكلية للحديد في بعض الحالات32، ولكن أكثر في كثير من الأحيان، يتم إضافة الحديد (II) إلى حضور وكلاء تخفيض33،34،35، 36 غالباً تحت38،37،أتوموسفيري اللاهوائية39، وفي بعض الحالات ليس من الحديد الزائد إزالة33،،من3436، تعقيد أي مقايسة اللاحقة. خطوات متعاقبة اللوني الكلاسيكية وجو اللاهوائية ليست واقعية بالنسبة للمختبرات الجامعية، مما دفع تطوير هذا البروتوكول.
أثناء إعداد دليل للعمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة وتجهيز العينات إلى حد كبير عن طريق الجاذبية تأخذ مزيدا من الوقت والجهد عند مقارنة بالأعمدة المعلبة والآلي أجهزة القياس اللوني، تسمح الخطوات اليدوية للتدريب العملي على تعلم الطالب الذي يؤدي إلى زيادة فهم العلم وراء هذه العملية. إضافة ملح الحديد (II) وفقا للشروط المبينة هنا حساس بشكل خاص إلى ديثيوثريتول الزائد. إذا كان طالب عن طريق الخطأ يضيف وجود فائض ديثيوثريتول، من المرجح حدث هطول الأمطار. ونحن قد وجدت أنه من المفيد تتطلب من الطلاب لإجراء عمليات حسابية لكميات كاشف قبل وصوله إلى المختبر، حيث يمكن استخدام الوقت المختبر الأكثر فعالية في مقاعد البدلاء. يمكن أن تتم تنقية ايماك benchtop أسرة-من تحلل الخلية إلى شطف البروتين-في فترة مختبر 4 ساعة واحدة، تليها إعادة تشكيل والمقايسة في فترة لاحقة مختبر.

التقارير الأولى لتنقية البروتين بوليهيستيديني معلم من مقتطفات كائن مضيف باستخدام عملية إزالة معدن ثقيل العلامة الحامض الأميني من معدن المعطل تداولها دخلت في الأدب في عام 19881،2. ومنذ ذلك الوقت، أصبحت إضافة العلامات بوليهيستيديني للبروتينات المؤتلف وعلى تنقية بتقارب معدنية المعطل تداولها اللوني (ايماك) في كل مكان تقريبا في الأدب البيوكيميائية3،4، 5. يمكن تنفيذ أساليب تنقية ايماك في benchtop، باستخدام الفصل اللوني للألى وتنسيقات عمود الدوران. حين تقارب أساليب تنقية، خاصة ايماك، تستخدم على نطاق واسع في مختبر أبحاث، فأقل شيوعاً في مختبر التدريس الجامعي. الكتب الأكثر استخداماً من مختبر لمختبر الكيمياء الحيوية لا تعلم بشكل روتيني هذه الأساليب، اختارت بدلاً من ذلك للتبادل الأيوني أكثر تقليدية أو صبغ ملزم اللوني6،،من78 , 9. على سبيل المثال، تنقية نازعة لاكتات أندرسون10 يستخدم تقارب بالصبغة الملزمة، والتنقية من حليب البقر α lactalbumin7،11 من بوير يستخدم من نيكل-نيتريلواسيتيك حمض مصفوفة، ولكن لا يوجد علامة المؤتلف بولي-الحامض الأميني، الاعتماد بدلاً من ذلك على تقارب جوهري من البروتين عن الراتنج. بعض المختبرات الجامعية الحديثة الكتب والمنشورات تنفيذ الفصل اللوني لتقارب معدنية المعطل تداولها في بولي-الحامض الأميني معلم البروتين أهدافا مثل البروتينات الأخضر أو الأحمر نيون12،13، 14،15و16من الأجسام المضادة والانزيمات المحددة17،18،،من1920، حتى بعض من وظيفة غير معروف21. يمكن القول بأن تنقية إنزيم الأفضل في مختبر التدريس، لأن الهدف الذي يمكن أن يكون جزيئي للنشاط في الدورات اللاحقة، إثراء تجربة "العلم الحقيقي" من جانب الطالب؛ وفي الواقع، تم نشر هذه الأنواع من التجارب المختبرية وأفادت نتائج مفيدة في تعلم الطلبة17،18،،من2021. وحتى الآن، استخدام تطبيقات ايماك لتنقية الإنزيم في تدريس مختبر تظل ضئيلة، وقد تفترض الأساليب المنشورة حتى الوصول إلى أجهزة القياس اللوني الذي لا يتوفر عادة للكيمياء الحيوية في المختبر الفصول الدراسية 20-وهناك أيضا أوجه القصور في تطبيق أي ماك ميتالوبروتينس، لا سيما تلك التي تربط المعادن divalent المراعية للأكسدة والاختزال التي تعتبر أساسية للنشاط22. وكثيراً ما أيون معدني مفقود أو تتأكسد أثناء تنقية الغلة إنزيم غير نشط غير ملائمة للمختبرات الجامعية.
ثلث كامل من إنزيمات الربط أيون معدني23، وعلى الرغم من مطلب يكاد يكون شاملا للحديد في جميع أشكال الحياة23، الحديد جدلا بين الأيونات المعدنية الأكثر إشكالية في علم الإنزيمات. عدم الهيم Fe2 + ملزمة الإنزيمات عرضه بوجه خاص لفقدان و/أو أكسدة المعدن أثناء ايماك؛ يفترض أنه نظراً لعدم وجود يجند العضوية مخصصة مثل الهيم والسهولة مع الذي Fe2 + يمكن أن ننأى عن الأحماض الأمينية يغاندس24. وعلاوة على ذلك، الأوكسجين تعتمد أكسدة Fe2 + إلى Fe3 + عفوية في المحلول، بسبب تغير الطاقة الحرة السلبية واستقرار نسبي في Fe3 +. وغالباً ما يتم التغلب على هذه التحديات باستخدام طرق الكروماتوغرافي الغلاف الجوي و/أو غير ايماك اللاهوائية22. في هذه المقالة، سوف نظهر استخدام benchtop ايماك لتنقية Fe2 + ميتالوينزيمي تعتمد لدوبا ديوكسيجيناسي استخدام اللوازم اللوني بسيطة وغير مكلفة، تليها إعادة تشكيل موقع نشط Fe2 +، و التحليل الأنزيمي. هذه الأساليب هي المعيار في مختبر الكيمياء الجامعية الخاصة بنا لمجموعات الطلاب 6-12 ويمكن استخدامها لتوسيع مرجع إنزيم التحقيقات على المستوى الجامعي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني (ايماك)، البروتينات بوليهيستيديني معلم يتقن بسهولة من طلاب المرحلة الجامعية، وأصبح الأسلوب تنقية البروتين الأكثر استخداماً في الأدبيات الحديثة. ولكن، تطبيق الفصل اللوني لتقارب ملزمة معدنية والبروتينات، وخاصة تلك مع الأكسدة المعادن الحساسة مثل الحديد، يقتصر غالباً على المختبرات مع الوصول إلى مربع القفازات-المعدات التي لا تتوفر بشكل روتيني في المرحلة الجامعية مختبر. في هذه المقالة، نظهر طرقنا benchtop للعزلة وإعادة تشكيل بولي-الحامض الأميني الموسومة تنقية وأيون المعدن ايماك، ديوكسيجيناسي اكستراديول الحديد الأكسدة النشطة، الهيم غير ملزم والمقايسة من ديوكسيجيناسي مع الركازة متنوعة تركيزات وتشبع الأكسجين. هذه الأساليب هي ينفذه طلاب المرحلة الجامعية وتنفيذها في مختبر التدريس والبحوث الجامعية مع الأجهزة التي متاحة وميسرة في المقام الأول من المؤسسات الجامعية.

وجمعت هذه النتائج ممثلة بطلاب المرحلة الجامعية كما أنها نفذت هذا البروتوكول خلال فترتين المختبر دورة 341 "بليون متر مكعب": "الكيمياء الحيوية التجريبية" في كلية Muhlenberg. يوضح الشكل 1 معلم ميتالوينزيمي، ديوكسيجيناسي لدوبا، كما يؤديها اثنين من الطلاب الجامعيين خلال فترة مختبر 4 ساعة الفصول الدراسية وتحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بنفس نتائج تنقية بولي كاتشين 20-الحامض الأميني الطلاب أثناء فترة مختبر لاحقة. بروتين بولي-الحامض الأميني الموسومة بشكل فعال المنقي (الشكل 1، لين 2). إيمونوبلوت من جل استخدام الأجسام المضادة ضد العلامة بولي-الحامض الأميني تشير إلى أن كمية صغيرة من البروتين المستهدف بولي-الحامض الأميني معلم يضيع في التدفق من خلال (البيانات لا تظهر)، المحتمل نظراً لأن أكبر من الكمية 100 ملغ من البروتين المستهدف في ليستي تجاوزت القدرة الملزمة من الراتنج.
الشكل 2 يوضح بيانات الأنشطة التي تجمع الطلاب على رد فعل الانزيمية من الحامض الأميني بولي متالونزيمي المعلمة الهدف، ديوكسيجيناسي لدوبا، بعد إعادة تشكيل مع الحديد (II) والترشيح جل اللاحقة كما هو موضح بالبروتوكول وهنا. والثاني الخمسة يبدأ التوقيت الميت قبل جمع البيانات نموذجية من الطلاب تنفيذ هذا الأسلوب للمرة الأولى. تم الكشف عن نشاط قوي متالونزيمي استخدام مقايسة منشورة، وأسفرت عن حالة ثابتة معلمات الحركية يتسق مع النتائج المنشورة29. معلمات الحركية الحالة المستقرة هي التي تحدد تركيب منحنيات التقدم30 هو مبين في الشكل 2؛ تركيب المربعات الصغرى غير الخطية للمعدلات الأولية التي تم جمعها على مدى سلسلة من تركيزات الركيزة غير نفس القدر الممكن31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> رقم 1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة26 تحليل بولي-الحامض الأميني معلم البروتين قبل وأثناء وبعد التنقية. الممرات 1-علامات الوزن الجزيئي، 2-تنقية البروتين (كاتشين 20) وظيفة ني-الإدارة الوطنية للسياحة، وتدفق 3-ني-الإدارة الوطنية للسياحة من خلال الحطام خلية-خلية مقتطفات النفط الخام مجاناً قبل تنقية، 5-4 بيليه بعد تحلل. وأعدت 5 × عينة/تحميل المخزن المؤقت باستخدام عينات وفصلها عن المواد الهلامية polyacrylamide مسبقة الصب 4-20 ٪ باستخدام نظام التفريد هلام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> الرقم 2. أعيد فحص حالة ثابتة من الحديد (II) متالونزيمي (أي، لدوبا ديوكسيجيناسي، 10 μm) مع الركازة (لدوبا-5 ميكرومتر (أحمر)، 25 ميكرومتر (الأخضر)، 50 ميكرومتر (أزرق)) في المخزن المؤقت (50 مم الفوسفات، وكلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8 200 ملم). تصوير آثار تشكيل المنتج في 414nm. تم اقتناء البيانات امتصاص باستمرار استخدام 1 مل ميثاكريلات الترعة في سبليت-شعاع المسح ضوئي الأشعة فوق البنفسجية-مرئية مطياف29. يتم احتواء البيانات الخام إلى نموذج ل تقريب حالة ثابتة (كم ± 30.8 ميكرومتر 14.4، كالقطالظاهر 2.3 s-1 ± 0.05) ميكايليس-مينتين30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

نقدم هنا بروتوكول benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني لتنقية وإعادة تشكيل اللاحقة من بوليهيستيديني معلم، والحديد الهيم غير ملزم ديوكسيجيناسي مناسبة للمختبر التدريس الجامعي.

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

واحد خطوه إثراء من الحنفية الموسومة histone deاسيتيل من الفطريات الخيطية الرشاشيات معشش لفحص النشاط الانزيمي

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

شبه كمية المخدرات تقارب استجابة الهدف الاستقرار (DARTS) دراسة التفاعل راباميسين / mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...