Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Denne publikation er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr.  CHE 1708237.

1. forberedelse til rensning
<ol><li>Forberedelse af den celle-gratis rå ekstrakt<ol>
<li>Opnå en ~ 9-10 g celle pellet af E. coli (BL21), overexpressed polyhistidine markeret metalloprotein25 i en 50 mL konisk slange.</li>
		<li>Der tilsættes 5 mL per gram af værelse temp lysis/bind buffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol ved pH 8) ~ 9-10 g celle pellet for en samlet mængde ~ 45-50 mL. Periodisk vortex at fremme opløsningen. Hvis pelleten var frosset, tø i et bad med lunkent vand.</li>
		<li>Bruger bad is-vand, chill cellesuspension til ~ 3 ° C i forberedelse til celle lysering. Bemærk: På dette punkt, celle lysering af sonikering, perle fræsning eller en anden metode er muligt. Perle fræsning er vist her, fordi det er hurtig og relativt billig, og kræver ikke høreværn.</li>
		<li>Samle en 50 mL perle fræsning kammer ifølge producentens anvisninger.</li>
		<li>Fyld perle mill salen halvt fuldt af kølet 0.1 mm glasperler, der er gemt på-20 ° C.</li>
		<li>Fyld resten af salen med den kølede cellesuspension og bruge 4 ° C lysis/bind buffer til at fylde salen helt.</li>
		<li>Brug en lille spatel til at rotere skaftet af perle mill og bland cellesuspension med perlerne.</li>
		<li>Fjern alle store bobler med en pipette, og derefter skrue låget på.</li>
		<li>Tør off kammer fra enhver lækage.</li>
		<li>Tilføje omkring 1 kop af is til den klare, plast jakke, invertere fyldt 50 mL kammer i is fyldt jakke og skrue lukket.</li>
		<li>Sikre is-dobbeltvægget salen på motoren.</li>
		<li>Vende perle mill motor på 15 sekunder ved 15,800 rpm, så giver mulighed for at hvile i 45 sekunder. Gentag 8 gange.</li>
		<li>Når de 8 cyklusser er komplet, dekanteres hele cellen lysis suspension i en 50 mL eller større rør normeret til høj hastighed centrifugering (25.000 x g eller højere). Placere et par på afbalanceret rør i centrifuge og spin på 25.000 x g i 40-45 minutter ved 4° C til pellet celle debris og glas perler. Bemærk: Hvis 50 mL eller større rør normeret til hurtig centrifugering ikke er tilgængelige, skal du fjerne glasperler ved centrifugering på 1000-2000 x g i 2-3 min. i en 50 mL konisk slange til at give en mindre mængde af cellesuspension (~ 25 mL), der kan være dekanteres i en mindre volumen e tube normeret til hurtig centrifugering.</li>
		<li>Når centrifugering er komplet, dekanteres klar, gul, celle-fri, rå ekstrakter til en ren 50 mL konisk slange. Passe på ikke for at overføre enhver celle debris.</li>
		<li>Saml et lille udsnit af de celle-gratis rå ekstrakter til senere analyse af rensning af SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af kolonnen IMAC<ol>
<li>Få en 1,5 x 20 cm kolonne udstyret med en lavere seng støtte til at bevare harpiks partikler, en Luer lock outlet og en øvre cap, der også indeholder en Luer lock montering. Passe Luer-lock outlet med en stophane til at styre strømmen.</li>
		<li>Arbejder på benchtop, sikkert montere kolonnen på ring stilling.</li>
		<li>Få en 50% opslemning af nikkel-bundet nitriloacetic syre (Ni-NTA) harpiks i 20% ethanol, der er blevet opbevaret ved 4 ° C.</li>
		<li>Forsigtigt swirl flaske for at jævnt genopslæmmes harpiks.</li>
		<li>Arbejder ved stuetemperatur og på benchtop, brug et gradueret pipette til at trække 2 mL af gylle, hvilket vil give 1 mL afgjort harpiks kan bindende 50-60 mg af polyhistidine markeret protein, og overføre gylle til kolonnen.</li>
		<li>Åbne hanen og tillade overskydende storage-løsning til at dræne af tyngdekraften fra harpiks.</li>
		<li>Luk hanen sikkert</li>
		<li>Ved hjælp af en Pasteur afpipetteres nøje tilføje kølet lysis/bind buffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol ved pH 8) og til kolonnen af harpiks – mindst 30 mL. Passe på ikke for at forstyrre harpiks overflade. Køre buffer ned væggene i kolonnen for at undgå sprøjt.</li>
		<li>Reagensglasset harpiks ved at tillade lysis/bind bufferen til at dræne langsomt fra kolonnen ved tyngdekraft i en samling bægerglas.</li>
		<li>Når lysis/bind buffer har for det meste drænet, lukke hanen for at standse strømmen af bufferen, når ~ 5 mL af lysisbuffer ligger fortsat over harpiks og lad kolonnen, monteret oprejst, indtil klar til at fortsætte eller i op til 1 uge.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rensning af Polyhistidine-markeret mål af IMAC
<ol><li>Forberede vaskebuffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol pH 8) og eluering buffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 10% glycerol pH 8). Chill ved 4° C.</li>
	<li>Forberede Ni-NTA kolonnen for tilsætning af celle-gratis rå uddrag ved at åbne hanen og giver mulighed for resterende lysis/binding buffer til at dræne af tyngdekraften gennem Ni-NTA harpiks. Når alle buffer har drænet, og harpiks overflade er udsat, lukke hanen.</li>
	<li>Ved hjælp af en Pasteur pipette, omhyggeligt afpipetteres uddrag celle gratis rå på harpiks, pas på ikke for at forstyrre overfladen. Kør de rå ekstrakter ned væggene i kolonnen for at undgå sprøjt. Mængden af rå ekstrakter anvendes er afhængig af størrelsen af udtryk af polyhistidine-mærkede protein; sikre, at den samlede mængde af rå ekstrakter indeholder 50-60 mg eller mindre for target proteinet pr. mL af Ni-NTA harpiks (Se trin 1.2.4).</li>
	<li>Når alle de rå uddrag er blevet overført til kolonnen, åbne hanen så kolonnen kan dræne af tyngdekraften. Dette flow gennem består af proteiner, der ikke binde til harpiks-indsamle 100 μL til senere analyse af rensning af SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>Viskositet af celle-gratis rå uddrag kan forsinke tyngdekraften strømmen af kolonnen betydeligt. For at øge hastigheden af strømmen, anvende en simpel "håndpumpe":<ol>
<li>Tag en 10 mL Luer-lock sprøjte og sammenknytte sig hen til fælles landbrugspolitik i kolonnen ved hjælp af en kort længde på plastslanger og Luer-lock fittings mellem kolonne cap og sprøjten. Trække ud sprøjte stemplet, og så passe stramt kolonne cap på toppen af kolonnen.</li>
		<li>Forsigtigt komprimere stemplet af sprøjten mens manuelt vurdere strømningshastigheden af indsamling af elueringsvæsken i et måleglas; 1-2 mL pr. minut er forenelig med harpiks og denne opsætning. Forsigtigt øge komprimering af sprøjten stemplet som strømningshastigheden bremser.</li>
		<li>For at forhindre indslæbning af luft i harpiks, fjerne kolonne cap og knyttet hånd-pumpen når menisken anvendt væskens når 5-10 mm over harpiks sengen og lade den resterende mængde at dræne af tyngdekraften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når celle gratis rå ekstrakter er færdig, dræne og harpiks overflade er udsat igen, bruge en Pasteur afpipetteres nøje tilføje ~ 30 mL af nedkølet vaskebuffer til kolonnen – pas på ikke for at forstyrre overfladen af harpiks. Køre buffer ned væggene i kolonnen for at undgå sprøjt.</li>
	<li>Åbne hanen og tillade wash bufferen til at løbe igennem kolonnen. Denne proces fjerner svagt bundne proteiner fra harpiks. Kassér elueringsvæsken.</li>
	<li>Mens vaskebuffer er dræning, forberede seksten, mærket, microcentrifuge rør til opsamling af 1 mL fraktioner.</li>
	<li>Når wash buffer har drænet, og harpiks overflade er udsat igen, skal du lukke hanen. Bruge en Pasteur afpipetteres nøje tilføje ~ 30 mL af kølet eluering buffer til kolonnen – pas på ikke for at forstyrre overfladen af harpiks. Køre buffer ned væggene i kolonnen for at undgå sprøjt.</li>
	<li>Åbne hanen langsomt og tillade eluering buffer at eluere polyhistidine markeret protein fra kolonnen. Indsamle 1 mL af elueringsvæsken i hver af de markerede microcentrifuge rør, 1 til 16.</li>
	<li>Teste brøker for protein ved hjælp af en kolorimetrisk protein assay som Bradford assay eller UV-synlige spektroskopi efter de metoder, der er bestemt af reagens og/eller instrument producenter27,28. Som vist her, er kolorimetrisk analysen ved hjælp af Coomassie blå skaleret ned til en 100 μL volumen for at ofre kun en lille mængde fra hver fraktion.</li>
	<li>Mix 3 μL af hver fraktion med 100 µL af en kolorimetrisk protein assay reagens og observere manuelt dannelsen af enhver farve til at angive tilstedeværelsen af protein i fraktion; der kræves ingen registrering med et spektrometer.</li>
	<li>Hvis protein er fundet i brøkdel 16, fortsat eluerer 1 mL brøker og analyse for protein med jævne mellemrum, indtil de eluted fraktioner ikke længere indeholde en betydelig mængde af protein.</li>
	<li>Kombinere protein-holdige fraktioner til en ren koniske rør, og trække en 100 μL prøve til senere analyse af SDS-PAGE26.</li>
	<li>Fortsætte med rekonstituering af metal ion cofaktor eller fryse protein i 3 mL alikvoter ved-80 ° C. Sikre, at 10% glycerol er inkluderet i eluering buffer er en kryoprotektant til at stabilisere den ren protein under frysepunktet.</li>
	<li>Når eluering af kolonnen Ni-NTA er komplet, dvs alle proteiner er slået fra kolonnen og indsamlet i fraktioner, passere en anden 25 mL af eluering buffer gennem kolonnen, og gemme kolonnen ved 4 ° C i ~ 5 mL af eluering buffer for kortvarig oplagring , eller lysis/bind buffer med 20% ethanol til langsigtede oplagring.</li>
</ol>3. rekonstituering af Target Protein med Fe2 +
<ol><li>Tilsætning af Fe2 + Bemærk: En ikke-hæm jern (II) bindende enzym, såsom L-DOPA dioxygenase i dette eksempel kræver en Fe2 + -ion aktivitet; dog oxiderer let jern (II) til jern (III), der er inaktive, og en brøkdel af proteinet renser uden nogen jern på alle.<ol>
<li>Til at begynde rekonstituering af metal, få 3 mL renset enzymet suspenderet i eluering buffer. Hvis de er frosset, tø hurtigt ved hjælp af et bad med lunkent vand, og når optøet, sætte proteinet på is.</li>
		<li>Ved hjælp af mængden af protein i røret, beregne mængden af natrium Ascorbat (198.1 g/mol) nødvendigt at foretage den endelige koncentration 12,5 mM i prøven. Også, beregne mængden af dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) nødvendigt at foretage den endelige koncentration 12,5 mM i prøven.</li>
		<li>Tilføj solid natrium Ascorbat og DTT og forsigtigt, men grundigt, mix for at opløses fuldstændigt. Passe på ikke for at forårsage protein nedbør med alt for aggressive blanding. Tilføje en lille mængde af jern (II) sulfat en (MW 278.01 g/mol) til protein prøven.</li>
		<li>For at opnå en lille nok mængde af jern salt, Tryk et par 1 mm granulat af FeSO4•7H2O solid ud på et stykke vejer papir, folde papiret over granulet og knuse den med den flade side af en metal spatel.</li>
		<li>Tilføje en korn af den resulterende pulver til rør af protein.</li>
		<li>Vortex at blande og et rosenrødt lyserød farve vises i røret.</li>
		<li>Inkuber den lyserøde løsning af protein, udjævnet, for 10-30 minutter på køl. Den lyserøde farve vil langsomt fade over tid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel filtrering<ol>
<li>Anvende en gel filtrering kolonne fyldt med 10 mL af sfæriske polyacrylamid gel med en molekylevægt udstødelse grænse på ca 6.000 og en hydreret partikel størrelse række 90 – 180 µm i en kolonne med 1,5 x 12 cm, som er også udstyret med en 10 mL reservoir. Kontroller kolonnen er udstyret med nederste og øverste seng understøtter i form af 30 um porøse polyethylen diske at bevare harpiks i kolonnen og forhindre harpiks bed i løb tør. Montere kolonnen gel filtrering til en ring stå.</li>
		<li>Hvis bruger en færdigpakket gel filtrering kolonne, fjerne hætten og hæld den overskydende buffer over den øverste seng støtte.</li>
		<li>For at Blandingen henstår kolonnen, begynde ved at fylde beholderen med buffer kompatibel med efterfølgende analyse og opbevaring, for eksempel, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol ved pH 8,0.</li>
		<li>Hvis bruger en færdigpakket gel filtrering kolonne, snap off den nederste spids af gel filtrering kolonne til at starte flow af buffer og udsætte Luer slip montering. Passer en stophane Luer slip slutningen af kolonnen, men lad det åbne og tillade kolonnen for at dryppe af tyngdekraften.</li>
		<li>Når bufferen er drænet fra kolonnen og den øverste seng støtte er udsat, lukke hanen, og tilføje ~ 3 mL af Fe (II) rekonstitueres metalloenzyme til kolonnen af pipettering løsning på den udsatte øverste seng støtte.</li>
		<li>Åbne hanen og give den hele 3,0 mL prøve at angive kolonnen ved hjælp af tyngdekraften. Kassér disse første 3 mL af elueringsvæsken. Enhver pink farve, der danner mens håndtering løsningen vil være fanget i toppen af kolonnen.</li>
		<li>Når kolonnen er stoppet dryppende og den øverste seng støtte er udsat, tilføje 4 mL af gel-filtrering buffer (f.eks. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol ved pH 8,0) til kolonnen. Åbne hanen og indsamle elueringsvæsken i microcentrifuge rør over otte 0,5 mL fraktioner.</li>
		<li>Teste brøker for protein ved hjælp af en kolorimetrisk protein assay eller UV-Vis27,28 , som beskrevet tidligere.</li>
		<li>Kombinere protein-holdige fraktioner.</li>
		<li>Trække en prøve for SDS-PAGE analyse26.</li>
		<li>Gå videre med analyse eller opbevaring af prøven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hochuli, E., Bannwarth, W., D&#246;beli, H., Gentz, R., St&#252;ber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Approach+to+Facilitate+Purification+of+Recombinant+Proteins+with+a+Novel+Metal+Chelate+Adsorbent.">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li><li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization.">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Biochemistry. , (1999).</li><li>Boyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).</li><li>le Maire, M., Chabaud, R., Herv&#233;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).</li><li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).</li><li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+chromatography+of+lactate+dehydrogenase:+An+experiment+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).</li><li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+milk+whey+&#945;-lactalbumin+by+immobilized+metal-ion+affinity+chromatography.">Purification of milk whey &#945;-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).</li><li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+mutation+to+protein+characterization.">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li><li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students:+An+illustration+of+protein+expression+and+purification*.">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li><li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li><li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education.">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li><li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protein+chemistry+laboratory.">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li><li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi.">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li><li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+writing-intensive,+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates.">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li><li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization:+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase.">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Known+structure,+unknown+function:+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course.">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li><li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes:+Use+of+Recombinant+Protein+Expression+and+Affinity+Tags+to+Aid+Identification+of+Native+Metal+Ion+Cofactors.">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry &amp; Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li><li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes.">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li><li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallo-Enzymes+and+Metallo-Proteins,+Chemistry+of.">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li><li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins+Using+the+pET+System.">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradford+Protein+Assay.">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Quantitation.">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li><li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li><li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+overexpression,+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2,3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum.">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li><li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li><li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis:+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition.">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li><li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification+and+properties+of+2,3-dihydroxyphenylpropionate+1,2-dioxygenase+from+Escherichiacoli.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li><li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2,3-Dihydroxyphenylpropionate+1,2-Dioxygenase+(MhpB).">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li><li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246,+His-199,+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2,3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1.">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li><li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC,+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase.">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li><li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ingen oplysninger.

Mens tilføjelsen af polyhistidine tags rekombinante proteiner og deres rensning af IMAC er blevet næsten allestedsnærværende i den biokemiske litteratur3,4,5, anvendelser af IMAC til enzym rensning i biokemi undervisning laboratorium fortsat er sparsom, og offentliggjort metoder mener ikke altid resource begrænsninger af undervisningen laboratorium20. Desuden er brug af IMAC i undervisningen laboratorium mest effektiv, når koblet til eksperimenter, der vurderer aktivitet og renhed, at gøre IMAC rensning af et enzym en ideel instruktions aktivitet. For at udvide anvendelsen af IMAC til rensning af enzymer, herunder metalloenzymer, i undervisningen laboratorium, er pålidelige og billige metoder nødvendige. I denne protokol, vi vise benchtop IMAC ved hjælp af let tilgængelige og billige laboratorie forsyninger, samtidig tage fat begrænsninger i anvendelsen af IMAC på metalloproteins22, af erstatningsgodtgørelse Aluminiumacetat afhængige metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, bogføre rensning. Ved hjælp af reagenser og materialer beskrevet, anslår vi forbrugsmaterialer til otte grupper af studerende koster mellem $500-600 pr. semester til at køre denne protokol, herunder analyse trinene i figur 1 og figur 2.
På grund af den lethed, hvormed Fe2 + kan tage afstand fra aminosyren ligander24 og letkøbt oxidation af Fe2 + O2 til Fe3 +, rekonstituering af ikke-hæm, er aminosyre-Chelateret Aluminiumacetat i en rekombinante metalloenzyme et typisk komponent af enzymet rensning. Når klassisk kromatografi bruges, er det muligt at undgå samlede tab af jern i nogle tilfælde32, men oftere, jern (II) er tilføjet tilbage i overværelse af reduktionsmiddel33,34,35, 36 ofte under en anaerob atomosphere37,38,39, og i nogle tilfælde den overskydende jern ikke er fjernet33,34,36, komplicerende enhver efterfølgende analyse. På hinanden følgende trin af klassisk kromatografi og en anaerob atmosfære er ikke realistisk for undergraduate laboratoriet, hvilket fik udviklingen af denne protokol.
Mens den manuelle forberedelse af kolonnen Ni-NTA og behandling af prøver i vid udstrækning af tyngdekraften tager ekstra tid og kræfter når sammenlignet med pre-pakkede kolonner og automatiseret kromatografi instrumentation, mulighed de manuelle trin hands-on at lære de studerende, der resulterer i øget forståelse for videnskaben bag processen. Tilsætning af jern (II) salt på betingelser beskrevet her er særligt følsomme over for overskydende dithiothreitol. Hvis en studerende fejlagtigt tilføjer et overskud af dithiothreitol, er en nedbør begivenhed sandsynligt. Vi har fundet det nyttigt at kræve studerende til at udføre beregninger af reagens mængder før ankommer i lab, så laboratorium tid kan udnyttes mest effektivt på bænken. Hele benchtop IMAC rensning - fra celle-lysis til protein eluering - kan ske i en periode på 4 timers laboratorium, efterfulgt af rekonstitution og analysen i en efterfølgende lab periode.

De første rapporter om rensning af et polyhistidine markeret protein fra uddrag af en værtsorganisme, ved hjælp af Chelat histidin tag af et immobiliseret metal ind i litteratur i 19881,2. Siden dengang, tilsætning af polyhistidine tags rekombinante proteiner og deres rensning af immobiliserede metal affinitet kromatografi (IMAC) har blive næsten allestedsnærværende i den biokemiske litteratur3,4, 5. IMAC rensning metoder kan gennemføres på benchtop, ved hjælp af automatiserede kromatografi og i spin-kolonne formater. Mens affinitet rensning metoder, især IMAC, er meget udbredt i forskningslaboratorium, er de mindre udbredt i undergraduate undervisning laboratorium. De mest udbredte laboratorium lærebøger for biokemi laboratorium lære ikke rutinemæssigt disse metoder, i stedet vælger mere traditionelle ionbytning eller farvestoffet-bindende kromatografi6,7,8 , 9. For eksempel rensning af laktat dehydrogenase af Anderson10 bruger affinitet af farvestoffet-bindende, og rensning af komælk α-lactalbumin7,11 af Boyer bruger en nikkel-nitriloacetic syre matrix, men ingen rekombinant poly-histidin tag, i stedet afhængige iboende affinitet af proteinet for harpiks. Nogle moderne bachelor laboratorium lærebøger og publikationer gennemfører immobiliseret metal affinitet kromatografi på poly-histidin markeret protein mål såsom grønt eller rødt-fluorescerende proteiner12,13, 14,15, antistoffer16og udvalgte enzymer17,18,19,20, selv nogle af ukendt funktion21. Velsagtens, rensning af et enzym er at foretrække i undervisningen laboratorium, fordi målet kan analyseres for aktivitet i efterfølgende sessioner, berige oplevelsen af "virkelige videnskab" hos studerende; disse typer af laboratoriet erfaringer er blevet offentliggjort, og gavnlige resultater på elevernes læring rapporteret17,18,20,21. Og endnu, anvendelser af IMAC til enzym rensning i biokemi undervisning laboratorium fortsat er sparsom, og de offentliggjorte metoder kan endda formoder adgang til kromatografi instrumentation, der er typisk ikke tilgængelig for brug i klasseværelset laboratorium 20. der er også begrænsninger i anvendelsen af IMAC på metalloproteins, især dem, som binder redox-følsomme divalent metaller, der er afgørende for aktivitet22. Ofte, er metal-ion mistet eller oxideret under rensningen giver en inaktiv enzym dårligt egnede til bachelor laboratoriet.
En fuld tredjedel af enzymer binder en metal-ion23, og trods en næsten universel forudsætning for jern i alle former for liv23, jern er uden tvivl blandt de mest problematiske metalioner i enzymology. Non-hæm Fe2 + bindende enzymer er særligt tilbøjelige til tab og/eller oxidation af metal under IMAC; formentlig på grund af manglende en dedikeret økologisk ligand som hæm og den lethed, med hvilken Fe2 + kan tage afstand fra aminosyren ligander24. Derudover er ilt afhængige oxidation af Fe2 + til Fe3 + spontan i vandig opløsning, på grund af negative fri energi ændringen og den relative stabilitet af Fe3 +. Ofte, overvinde disse udfordringer ved brug af anaerobe atmosfære og/eller ikke-IMAC kromatografiske metoder22. I denne artikel vil vi demonstrere brugen af benchtop IMAC til at rense de Fe2 + afhængige metalloenzyme L-DOPA dioxygenase ved hjælp af enkle, billige kromatografi forsyninger, efterfulgt af opløsning af det aktive sted Fe2 +, og enzymatisk assay. Disse metoder er standard i vores egen bachelor biokemi laboratorium af 6-12 grupper af studerende og kan bruges til at udvide repertoiret af enzymet undersøgelser på bachelor-niveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Benchtop immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC), af polyhistidine markeret proteiner er let masteret af bachelorstuderende og er blevet den mest anvendte protein oprensning metode i den moderne litteratur. Men anvendelsen af affinitet kromatografi til metal bindende proteiner, især dem med redox følsomme metaller som jern, er ofte begrænset til laboratorier med adgang til en handske boks - udstyr, ikke der er rutinemæssigt rådighed i the bachelor laboratorium. I denne artikel vil vise vi vores benchtop metoder til isolering, IMAC rensning og metal-ion rekonstituering af en poly-histidin markeret, redox-aktive, ikke-hæm jern bindende extradiol dioxygenase og analyse af dioxygenase med varieret underlag koncentrationer og mætte ilt. Disse metoder er udført af studerende og implementeret i undergraduate undervisning og forskning laboratorium med instrumentering, som er tilgængelige og økonomisk overkommelige på primært bachelor institutioner.

Disse repræsentative resultater blev indsamlet af studerende, som de udføres denne protokol i to kursus laboratorium perioder af BCM 341: eksperimenterende biokemi på Muhlenberg College. Figur 1 viser resultaterne af rensning af en 20 kDa poly-histidin tagged metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, som udføres af to studerende i en 4-timers klasseundervisning laboratorium periode og analyseret af SDS-PAGE ved det samme studerende i et laboratorium, der efterfølgende periode. Poly-histidin markeret protein er effektivt renset (figur 1, lane 2). En immunblot gel ved hjælp af antistof mod poly-histidin tag angiver, at en lille mængde af poly-histidin markeret target proteinet er tabt i flow-gennem (data ikke vist), sandsynligvis fordi jo større end 100 mg mængden af target proteinet i at lysate overskredet bindende kapacitet af harpiks.
Figur 2 viser studerende-indsamlet aktivitetsdata på enzymatisk reaktion af poly-histidin mærket metalloenzyme mål, L-DOPA dioxygenase, efter rekonstituering med jern (II) og efterfølgende gel-filtrering som beskrevet af protokollen heri. De fem sekund døde-tid før data indsamlet begynder er typisk for studerende udfører denne teknik for første gang. Den robuste aktivitet af metalloenzyme blev fundet ved hjælp af en offentliggjort assay, og givet steady-state kinetiske parametre i overensstemmelse med offentliggjorte resultater29. Steady-state kinetiske parametre blev bestemt ved at montere fremskridt kurver30 vist i figur 2. ikke-lineær mindste kvadraters montering af oprindelige satser indsamlet over en række substrat koncentrationer er dog lige så muligt31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figur 1. SDS-PAGE26 analyse af poly-histidin markeret protein før, under og efter rensning. Baner 1 - molekylvægt markører, 2-renset protein (20 kDa) post Ni-NTA, 3-Ni-NTA flow gennem 4 - celle gratis rå ekstrakter inden rensning, 5 - celle-debris pellet post lysering. Prøver var tilberedt med 5 x prøve/Loading bufferen og adskilt på færdigstøbte 4-20% polyacrylamidgeler ved hjælp af en gel elektroforese system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figur 2. Steady state assay af jern (II) rekonstitueres metalloenzyme (dvs. L-DOPA dioxygenase, 10µM) med substrat (L-DOPA-5 µM (rød), 25 µM (grøn), 50 µM (blå)) i buffer (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8). Spor skildrer produkt dannelse på 414nm. Absorbansen data blev løbende anskaffes ved hjælp af 1 mL methacrylat kuvetter i et split-beam scanning UV-synlige spektrometer29. RAW-data er egnet til en model af Michaelis-Menten steady-state tilnærmelse (KM 30,8 µM ± 14,4, kkattilsyneladende 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Her præsenterer vi en protokol for benchtop immobiliseret metal affinitet kromatografi rensning og efterfølgende rekonstituering af en polyhistidine, der er markeret, ikke-hæm jern bindende dioxygenase egnet for undergraduate undervisning laboratorium.

Benchtop immobiliseret Metal affinitet kromatografi, rekonstitution og analyse af en Polyhistidine mærkede Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Enkelt trin berigelse af en TAP-Tagged Histon Deacetylase af Filamentous svamp Aspergillus nidulans for enzymatisk aktivitetsanalyse

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...