Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
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Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

यह प्रकाशन अनुदान सं के अंतर्गत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है ।  चे १७०८२३७.

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लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

जबकि रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और imac द्वारा उनकी शुद्धि के लिए polyhistidine टैग के अलावा जैव रासायनिक साहित्य में वस्तुतः सर्वव्यापी हो गया है3,4,5, एंजाइम शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन जैव रसायन शिक्षण प्रयोगशाला में विरल रहना, और प्रकाशित तरीकों हमेशा शिक्षण प्रयोगशाला20के संसाधन सीमाओं पर विचार नहीं है । इसके अलावा, शिक्षण प्रयोगशाला में IMAC का उपयोग सबसे प्रभावी है जब प्रयोगों के लिए युग्मित है कि गतिविधि और पवित्रता का आकलन, एक एंजाइम एक आदर्श अनुदेशात्मक गतिविधि के IMAC शोधन कर । आदेश में metalloenzymes सहित एंजाइमों की शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन का विस्तार करने के लिए, शिक्षण प्रयोगशाला में, विश्वसनीय और सस्ती तरीकों की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित benchtop imac आसानी से उपलब्ध है और सस्ती प्रयोगशाला की आपूर्ति का उपयोग करते हुए भी22metalloproteins को imac के आवेदन में सीमाओं को संबोधित करते हुए आयरन (द्वितीय) निर्भर पुनर्गठन द्वारा metalloenzyme, L-डोपा dioxygenase, पद शुद्धि । रिएजेंट और सामग्री का उपयोग करते हुए वर्णित है, हम आठ छात्र समूहों के लिए उपभोग्य सामग्रियों की लागत का अनुमान $500-600 प्रति सेमेस्टर के बीच इस प्रोटोकॉल, विश्लेषण चित्रा 1 और चित्रा 2में उल्लिखित चरणों सहित चलाने के लिए है ।
कारण आसानी से जो fe2 + एमिनो एसिड लाइगैंडों24 और 2 fe के सतही ऑक्सीकरण से अलग कर देना कर सकते है+ 2 से fe 3 +, गैर के पुनर्गठन-षयवस्तु, एमिनो एसिड-chelated आयरन (द्वितीय) एक रिकॉमबिनेंट metalloenzyme में है एंजाइम शुद्धि का एक विशिष्ट घटक । जब शास्त्रीय क्रोमैटोग्राफी प्रयोग किया जाता है, यह कुछ मामलों३२में लोहे के कुल नुकसान से बचने के लिए संभव है, लेकिन अधिक बार, आयरन (द्वितीय) एजेंटों को कम करने की उपस्थिति में वापस जोड़ा जाता है३३,३४,३५, ३६ अक्सर एक anaerobicatomosphere३७,३८,३९के तहत, और कुछ मामलों में अतिरिक्त लोहा नहीं निकाला जाताहै ३३, ३४,३६, उलझी किसी भी बाद परख । शास्त्रीय क्रोमैटोग्राफी और एक anaerobic वातावरण के लगातार कदम स्नातक प्रयोगशाला के लिए यथार्थवादी नहीं हैं, इस प्रोटोकॉल के विकास को उत्साह ।
जबकि नी-ंत् कॉलम और नमूनों के प्रसंस्करण के लिए काफी हद तक गुरुत्वाकर्षण द्वारा मैनुअल तैयारी अतिरिक्त समय और प्रयास जब पूर्व पैक कॉलम और स्वचालित क्रोमैटोग्राफी इंस्ट्रूमेंटेशन की तुलना में ले करता है, मैनुअल कदम हाथ पर अनुमति देने के लिए इस प्रक्रिया के पीछे विज्ञान की वृद्धि हुई समझ में परिणाम है कि छात्र द्वारा सीखना । एक लोहे के अलावा (द्वितीय) यहां उल्लिखित शर्तों के तहत नमक विशेष रूप से अतिरिक्त dithiothreitol के प्रति संवेदनशील है । यदि एक छात्र गलती से dithiothreitol की एक अतिरिक्त कहते हैं, एक वर्षण घटना की संभावना है । हम इसे प्रयोगशाला में पहुंचने से पहले छात्रों को एजेंट मात्रा की गणना करने के लिए की आवश्यकता करने के लिए उपयोगी पाया है, तो लेबोरेटरी समय बेंच पर सबसे प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरे benchtop IMAC शुद्धि-सेल से प्रोटीन रेफरेंस के लिए lysis-एक 4 घंटे की प्रयोगशाला अवधि में पूरा किया जा सकता है, पुनर्गठन और बाद में एक प्रयोगशाला अवधि में परख के बाद ।

एक polyhistidine की शुद्धि की पहली रिपोर्ट एक मेजबान जीव के अर्क से एक केलेशनथेरेपी histidine टैग का उपयोग कर एक मैटीरियल धातु के द्वारा टैग की गईं साहित्य में प्रवेश किया १९८८1,2। उस समय के बाद से polyhistidine टैग के अलावा रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और उनके शोधन द्वारा मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC) जैव रासायनिक साहित्य में वस्तुतः सर्वव्यापी हो गए हैं3,4, 5. IMAC शुद्धि विधियों benchtop पर लागू किया जा सकता है, स्वचालित क्रोमैटोग्राफी और स्पिन में उपयोग-कॉलम प्रारूपों । जबकि समानता शोधन विधियों, विशेष रूप से IMAC, व्यापक रूप से अनुसंधान प्रयोगशाला में उपयोग किया जाता है, वे स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला में कम आम हैं । जैव रसायन प्रयोगशाला के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगशाला पाठ्यपुस्तकों नियमित रूप से इन तरीकों सिखाने नहीं है, बजाय अधिक पारंपरिक आयन के लिए चुनने-विनिमय या डाई-क्रोमैटोग्राफी6,7,8 बंधन , 9. उदाहरण के लिए, एंडरसन द्वारा स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की शुद्धि10 डाई-बाध्यकारी द्वारा संबध का उपयोग करता है, और गोजातीय दूध α की शुद्धि-lactalbumin7,11 बोयर द्वारा एक निकल-nitriloacetic का उपयोग करता है एसिड मैट्रिक्स, लेकिन कोई रिकॉमबिनेंट पाली-histidine टैग, बजाय राल के लिए प्रोटीन का आंतरिक संबंध पर भरोसा । कुछ आधुनिक स्नातक प्रयोगशाला की पाठ्यपुस्तकों और प्रकाशनों पाली पर मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी लागू करना-histidine जैसे हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में चिह्नित प्रोटीन लक्ष्य12,13, 14,15, एंटीबॉडी16, और चयनित एंजाइमों17,18,19,20, यहां तक कि कुछ अज्ञात समारोह21. यकीनन, एक एंजाइम की शुद्धि शिक्षण प्रयोगशाला में बेहतर है, क्योंकि लक्ष्य अनुवर्ती सत्रों में गतिविधि के लिए परख किया जा सकता है, छात्र की ओर से "वास्तविक विज्ञान" के अनुभव को समृद्ध; दरअसल, प्रयोगशाला के अनुभवों के इन प्रकार प्रकाशित किया गया है और छात्र सीखने पर लाभकारी परिणाम17,18,20,21की सूचना दी । और अभी तक, जैव रसायन शिक्षण प्रयोगशाला में एंजाइम शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन विरल रह, और प्रकाशित तरीकों भी क्रोमैटोग्राफी इंस्ट्रूमेंटेशन कि कक्षा प्रयोगशाला में उपयोग के लिए आम तौर पर उपलब्ध है करने के लिए उपयोग अनुमान हो सकता है 20. वहां भी metalloproteins के लिए IMAC के आवेदन में सीमाएं हैं, विशेष रूप से उन जो redox-संवेदनशील divalent धातुओं कि22गतिविधि के लिए आवश्यक है बांध । अक्सर, धातु आयन खो दिया है या एक निष्क्रिय एंजाइम बीमार स्नातक प्रयोगशाला के लिए अनुकूल उपज शुद्धिकरण के दौरान ऑक्सीकरण हो जाता है ।
एंजाइमों की एक पूरी एक तिहाई एक धातु आयन23बांध, और23जीवन के सभी रूपों में लोहे के लिए एक लगभग सार्वभौमिक आवश्यकता के बावजूद, आयरन enzymology में सबसे समस्याग्रस्त धातु आयनों के बीच यकीनन है । गैर षयवस्तु Fe2 + binding एंजाइमों विशेष रूप से IMAC के दौरान नुकसान और/ संभवतः षयवस्तु की तरह एक समर्पित कार्बनिक ligand की कमी के कारण और आसानी जिसके साथ2 Fe + एमिनो एसिड24लाइगैंडों से अलग कर देना कर सकते हैं । इसके अलावा, ऑक्सीजन के आश्रित ऑक्सीकरण2 fe + करने के लिए3 + + को जलीय समाधान में सहज है, नकारात्मक मुक्त ऊर्जा परिवर्तन के कारण और Fe 3 के सापेक्ष स्थिरता+। अक्सर, इन चुनौतियों anaerobic वातावरण और/या गैर IMAC क्रोमेटोग्राफिक तरीकों22के उपयोग से दूर कर रहे हैं । इस अनुच्छेद में, हम benchtop IMAC के उपयोग के लिए Fe2 + निर्भर metalloenzyme एल शुद्ध-डोपा सरल, सस्ती क्रोमैटोग्राफी आपूर्ति, सक्रिय साइट Fe2 +के पुनर्गठन के बाद का उपयोग कर dioxygenase, और प्रदर्शन करेंगे एंजाइमी परख । इन तरीकों को 6-12 छात्र समूहों की हमारी खुद की स्नातक जैव रसायन प्रयोगशाला में मानक है और स्नातक स्तर पर एंजाइम जांच के प्रदर्शनों की प्रक्रिया का विस्तार किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC), के polyhistidine टैग प्रोटीन आसानी से स्नातक छात्रों द्वारा महारत हासिल है और आधुनिक साहित्य में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटीन शोधन पद्धति बन गया है । लेकिन, धातु बंधन प्रोटीन के लिए अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के आवेदन, विशेष रूप से ऐसे आयरन के रूप में redox संवेदनशील धातुओं के साथ उन, अक्सर एक दस्ताने बॉक्स-उपकरण है कि स्नातक में नियमित रूप से उपलब्ध नहीं है के लिए उपयोग के साथ प्रयोगशालाओं तक ही सीमित है प्रयोगशाला. इस अनुच्छेद में, हम अलगाव के लिए हमारे benchtop तरीकों का प्रदर्शन, IMAC शुद्धि और धातु-आयन एक पाली के पुनर्गठन-histidine टैग, redox सक्रिय, गैर षयवस्तु लौह बंधन extradiol dioxygenase और विभिंन सब्सट्रेट के साथ dioxygenase की परख सांद्रता और संतृप्ति ऑक्सीजन । इन तरीकों स्नातक छात्रों द्वारा क्रियान्वित कर रहे है और उपकरण के साथ स्नातक अध्यापन और अनुसंधान प्रयोगशाला में कार्यांवित किया है कि सुलभ और सस्ती है मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में ।

ये प्रतिनिधि परिणाम स्नातक छात्रों द्वारा एकत्र के रूप में वे बीसीएम ३४१ के दो पाठ्यक्रम प्रयोगशाला अवधि के दौरान इस प्रोटोकॉल को मार डाला: Muhlenberg कॉलेज में प्रयोगात्मक जैव रसायन थे । चित्रा 1 एक 20 केडीए पाली-histidine टैग metalloenzyme, एल-डोपा dioxygenase की शुद्धि के परिणामों को दर्शाता है, के रूप में एक 4 घंटे कक्षा प्रयोगशाला अवधि के दौरान दो स्नातक छात्रों द्वारा प्रदर्शन किया और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ उसी के द्वारा अनुवर्ती प्रयोगशाला अवधि के दौरान छात्र । पाली-histidine टैग प्रोटीन प्रभावी ढंग से शुद्ध (चित्रा 1, लेन 2) है । पाली-histidine टैग के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर जेल का एक immunoblot इंगित करता है कि पाली-histidine लक्ष्य प्रोटीन की एक छोटी राशि प्रवाह में खो दिया है के माध्यम से (डेटा नहीं दिखाया गया है), की संभावना है क्योंकि अधिक से अधिक १०० मिलीग्राम लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा में lysate राल की बाध्यकारी क्षमता से अधिक है ।
चित्रा 2 प्रदर्शित करता है कि पाली के एंजाइमी प्रतिक्रिया पर छात्र एकत्र गतिविधि डेटा-histidine टैग metalloenzyme लक्ष्य, एल डोपा dioxygenase, लौह के साथ पुनर्गठन के बाद (द्वितीय) और बाद में जेल-निस्पंदन के रूप में प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित इस. पांच सेकंड मृत समय से पहले एकत्र डेटा शुरू होता है पहली बार के लिए इस तकनीक का निष्पादन छात्रों की खासियत है । metalloenzyme की मजबूत गतिविधि एक प्रकाशित परख का उपयोग कर पाया गया था, और स्थिर राज्य काइनेटिक पैरामीटर प्रकाशित परिणामों के अनुरूप29उपज । संभल-राज्य काइनेटिक मापदंडों30 चित्रा 2में दिखाया प्रगति घटता द्वारा निर्धारित किया गया; हालांकि, गैर रेखीय कम प्रारंभिक दरों की फिटिंग सब्सट्रेट सांद्रता की एक श्रृंखला पर एकत्र की एक समान रूप से संभव है31।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> चित्र 1. एसडीएस-पृष्ठ26 पाली के विश्लेषण-histidine से पहले प्रोटीन टैग, के दौरान और शुद्धि के बाद । गलियाँ 1-आणविक वजन मार्करों, 2-शुद्ध प्रोटीन (20 केडीए) पोस्ट नी-ंत्, 3-ni-ंत् प्रवाह के माध्यम से, 4 सेल मुक्त क्रूड अर्क शुद्धि से पहले, 5 सेल मलबे गोली पोस्ट lysis । नमूने 5x नमूना/लोडिंग बफर का उपयोग कर तैयार किया गया था और एक जेल ट्रो प्रणाली का उपयोग कर पूर्व कास्ट 4-20% polyacrylamide जैल पर अलग । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> चित्र 2. स्थिर लोहे के राज्य परख (द्वितीय) पुनर्गठन metalloenzyme (यानी, एल-डोपा dioxygenase, 10 µ एम) सब्सट्रेट के साथ (एल-डोपा-5 µ मीटर (लाल), 25 µ मीटर (ग्रीन), ५० µ मीटर (नीला)) बफर में (५० mm फास्फेट, २०० mm NaCl, पीएच 8). निशान 414nm में उत्पाद के गठन का चित्रण । अवशोषित डेटा लगातार एक विभाजन-बीम स्कैनिंग यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोमीटर29में 1 मिलीलीटर methacrylate cuvettes का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । कच्चे डेटा Michaelis-मेनटेन स्थिर राज्य सन्निकटन (kएम ३०.८ µ एम ± १४.४, कश्मीरकैटस्पष्ट २.३ एस-1 ± ०.०५)30के एक मॉडल के लिए फिट कर रहे हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

यहां हम benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में एक polyhistidine टैग की गई, गैर षयवस्तु लौह बंधन स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला के लिए उपयुक्त dioxygenase ।

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी, पुनर्गठन और एक Polyhistidine की परख स्नातक प्रयोगशाला के लिए Metalloenzyme टैग

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

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