Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Denne publikasjonen er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr.  CHE 1708237.

1. forberedelse for rensing
<ol><li>Utarbeidelse av celle-fri rå ekstrakt<ol>
<li>Få ~ 9-10 g cellen pellets av E. coli (BL21) som overexpressed polyhistidine merket metalloprotein25 i et 50 mL konisk rør.</li>
		<li>Legge til 5 mL per gram rom temp lysis/binde buffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole ved pH 8) de ~ 9-10 g cellen pellet for et totalvolum ~ 45-50 mL. Regelmessig vortex å oppmuntre oppløsning. Hvis pellet var frosset, tine i lunket vannbad.</li>
		<li>Bruker is-vannbad, chill celle suspensjon ~ 3 ° c i forberedelse til celle lysis. Merk: På dette punktet, celle lysis av sonication, perle fresing eller en annen metode er mulig. Perle fresing er demonstrert her fordi det er rask, relativt billig, og ikke krever hørselvern.</li>
		<li>Montere en 50 mL perle fresing kammer i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Fyll perle mill kammer halvfull av kjølt 0,1 mm glassperler som er lagret på 20 ° C.</li>
		<li>Fylle resten av kammeret med kjølt celle suspensjon og bruke 4 ° C lysis/binde buffer til å fylle kammeret helt.</li>
		<li>Bruk en liten spatel å dreie skaftet av møllen perle og bland celle suspensjon med perler.</li>
		<li>Fjern alle store bobler med en Pipetter, og så skru på lokket.</li>
		<li>Tørke av kammeret fra noen lekkasje.</li>
		<li>Legg ca 1 kopp is til klare, plast jakken, invertere fylte 50 mL kammeret i isen fylt jakke og skruen lukket.</li>
		<li>Sikre is-jacketed kammeret til motoren.</li>
		<li>Slå perle møllen motor på 15 sekunder på 15,800 rpm og la hvile i 45 sekunder. Gjenta 8 ganger.</li>
		<li>Når de 8 syklusene er fullført, Dekanter hele cellen lysis suspensjon i en 50 mL eller større rør vurdert for høyhastighets sentrifugering (25.000 x g eller høyere). Sett et par balansert rør i sentrifuge og spinn på 25.000 x g i 40-45 minutter på 4° C pellets celle rusk og glassperler. Merk: Hvis 50 mL eller større rør vurdert for høyhastighets sentrifugering ikke er tilgjengelig, fjerne glassperler ved sentrifugering på 1000-2000 x g i 2-3 min i et 50 mL konisk rør til et mindre volum celle suspensjon (~ 25 mL) som kan være decanted i et mindre volum e tube vurdert for høyhastighets sentrifugering.</li>
		<li>Når sentrifugering er fullført, Dekanter klart, gul, celle-fri, råolje ekstrakter inn i et rent 50 mL konisk rør. Ta vare ikke for å overføre noen celle rusk.</li>
		<li>Samle inn et lite utvalg av celle-fri råolje ekstrakter for senere analyse av rensingen ved SDS side26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utarbeidelse av kolonnen IMAC<ol>
<li>Få en 1,5 x 20 cm kolonne utstyrt med en lavere seng å beholde harpiks partikler, en Luer lås stikkontakt og en øvre cap som også inneholder en Luer lås passende. Passe Luer-lock stikkontakt med en stopcock til å kontrollere flyt.</li>
		<li>Arbeider på Borstemmaskin, sikkert montere kolonnen på ringen stå.</li>
		<li>Få en 50% slurry nikkel-bundet nitriloacetic syre (Ni-NTA) harpiks i 20% etanol som er lagret på 4 ° C.</li>
		<li>Forsiktig swirl flasken å jevnt re suspendere harpiks.</li>
		<li>Arbeider ved romtemperatur og Borstemmaskin, bruk en uteksaminert Pipetter å trekke 2 mL slurry, som vil gi 1 mL av avgjort harpiks i stand til å binde 50-60 mg polyhistidine merket protein, og overføre til slurry til kolonnen.</li>
		<li>Åpne stopcock og la den overskytende lagringsløsningen renne av tyngdekraften fra harpiks.</li>
		<li>Lukk stopcock sikkert</li>
		<li>Bruke en Pasteur Pipetter, nøye legge til kjølt lysis/binde buffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole ved pH 8) og kolonnen av harpiks-minst 30 mL. Ta vare ikke for å forstyrre harpiks overflaten. Kjør bufferen ned veggene i kolonnen for å hindre sprut.</li>
		<li>Equilibrate harpiksen ved at lyse/binde bufferen renne sakte kolonnen av tyngdekraften til en samling kanne.</li>
		<li>Når lysis/binde bufferen har hovedsakelig drenert, lukke stopcock for å stoppe flyten av bufferen når ~ 5 mL lyseringsbuffer står ovenfor harpiks og la kolonnen montert oppreist, helt klar til å fortsette eller opptil 1 uke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rensing av Polyhistidine-merket mål av IMAC
<ol><li>Forbered vaskebuffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8) og elueringsbufferen (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 10% glyserol pH 8). Chill på 4° C.</li>
	<li>Forberede kolonnen Ni-NTA tillegg av celle-fri råolje ekstrakter ved åpning av stopcock og la gjenværende lysis binding buffer renne av tyngdekraften gjennom Ni-NTA harpiks. Når alle bufferen har drenert, og harpiks overflaten er utsatt, lukker du stopcock.</li>
	<li>Bruke en Pasteur Pipetter, nøye Pipetter cellen gratis råoljen trekker ut på harpiks, ta vare ikke for å forstyrre overflaten. Kjør råolje ekstrakter ned veggene i kolonnen for å hindre sprut. Volumet av råolje ekstrakter brukes er avhengig av nivået av uttrykk for polyhistidine-merket protein; sikre det totale volumet av råolje ekstrakter inneholder 50-60 mg eller mindre mål protein per mL av Ni-NTA harpiks (se trinn 1.2.4).</li>
	<li>Når alle råolje ekstrakter har blitt overført til kolonnen, åpne stopcock slik at kolonnen kan renne av tyngdekraften. Denne flyten gjennom består av proteiner som ikke ble bundet til harpiks-samle 100 μL for senere analyse av rensingen av SDS-side. 26
</li>
	<li>Viskositet av celle-fri råolje ekstrakter kan redusere tyngdekraften flyten av kolonnen betraktelig. For å øke frekvensen av flyt, kan du bruke en enkel "hånd-pumpe":<ol>
<li>Ta en 10 mL Luer-lock-sprøyter og koble den til hetten kolonnen bruker en kort lengde på plast slangen og Luer-lock beslag mellom kolonne hetten og sprøyten. Trekke ut sprøytestempelet og deretter tett tilpasse kolonnen hetten på toppen av kolonnen.</li>
		<li>Forsiktig komprimere stempelet til sprøyten samtidig manuelt vurdere infusjonshastigheten ved å samle eluent i en uteksaminert sylinder; 1-2 mL per minutt er kompatibel med harpiks og dette oppsettet. Forsiktig øke komprimeringen av sprøytestempelet som infusjonshastigheten bremser.</li>
		<li>Innføring av luft i harpiks, fjerne kolonnen hetten og festet håndpumpe når meniscus av anvendt væsken når 5-10 mm over massen og tillate gjenværende volumet renne av tyngdekraften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når cellen gratis råolje ekstrakter er ferdig drenering og harpiks overflaten er utsatt igjen, bruke en Pasteur Pipetter forsiktig legge ~ 30 mL kjølt vaskebuffer kolonnen-ta vare ikke for å forstyrre overflaten av harpiks. Kjør bufferen ned veggene i kolonnen for å hindre sprut.</li>
	<li>Åpne stopcock og tillate vaskebuffer renne gjennom kolonnen. Denne prosessen fjerner svakt bundet proteiner fra harpiks. Kast eluent.</li>
	<li>Mens vaskebuffer er drenering, forberede seksten, merket, microcentrifuge rør for å samle 1 mL fraksjoner.</li>
	<li>Når vaskebuffer har drenert, og harpiks overflaten er utsatt igjen, Lukk stopcock. Bruk en Pasteur Pipetter forsiktig legge ~ 30 mL Kaldtvanns elueringsrør bufferen til kolonnen-ta vare ikke for å forstyrre overflaten av harpiks. Kjør bufferen ned veggene i kolonnen for å hindre sprut.</li>
	<li>Åpne stopcock sakte og la elueringsbufferen å elute polyhistidine merket protein fra kolonnen. Samle 1 mL av eluent i hvert av de merkede microcentrifuge rør, 1 til 16.</li>
	<li>Teste fraksjoner for protein bruker en kolorimetrisk protein analysen som Bradford analysen eller UV-synlig spektroskopi ifølge metodene bestemt av reagens og/eller instrument produsenter27,28. Som vist her, nedskalert kolorimetrisk analysen bruker Coomassie blå til et 100 μL volum for å ofre bare et lite volum fra hver fraksjon.</li>
	<li>Mix 3 μL av hver fraksjon med 100 µL av et fargemetrisk protein analysen reagens og observere manuelt dannelsen av en farge for å indikere tilstedeværelse av protein i fraksjonen; oppdagelsen med et spektrometer er ikke nødvendig.</li>
	<li>Hvis protein i del 16, Fortsett eluting 1 mL brøker og analysen for protein regelmessig til eluted fraksjoner ikke lenger inneholder en betydelig mengde protein.</li>
	<li>Kombinere protein inneholder brøker i en ren konisk rør, og trekke en 100 μL prøve for senere analyse av SDS side26.</li>
	<li>Fortsette med rekonstituering av metall ion kofaktor eller fryse protein i 3 mL dele på-80 ° C. Sikre at 10% glyserol er inkludert i tilsettes buffer er en kryoprotektant å stabilisere ren protein under frysepunktet.</li>
	<li>Når elueringsrør i kolonnen Ni-NTA er fullført, dvs alle protein er av kolonnen og samlet i fraksjoner, passerer en annen 25 mL av elueringsbufferen gjennom kolonnen, og lagre kolonnen på 4 ° C i ~ 5 mL elueringsbufferen for kortsiktige lagring , eller lyse/binde buffer med 20% etanol for lengre tids oppbevaring.</li>
</ol>3. rekonstituering målet protein med Fe2 +
<ol><li>Tillegg av Fe2 + Merk: En ikke-heme jern (II) bindende enzym, som L-DOPA dioxygenase i dette krever en Fe2 + ion for aktivitet. men jern (II) oksiderer lett til jern (III), som er inaktiv, og en brøkdel av protein renser uten noen jern hele.<ol>
<li>For å begynne rekonstituering av metall, få 3 mL renset enzymet suspendert i elueringsbufferen. Hvis frosset, tine raskt bruke en lunken vannbad og når tint, lagt protein på is.</li>
		<li>Bruke volumet av protein i røret, beregne hvor mye natrium ascorbate (198.1 g/mol) nødvendig for å gjøre endelige konsentrasjonen 12.5 mM i utvalget. Også beregne hvor mye dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) nødvendig for å gjøre endelige konsentrasjonen 12.5 mM i utvalget.</li>
		<li>Legge til solid natrium ascorbate og DTT og forsiktig, men grundig, bland for å oppløse helt. Ta vare ikke for å forårsake protein nedbør med aggressiv miksing. Legge til en liten mengde jern (II) sulfate heptahydrate (MW 278.01 g/mol) protein prøven.</li>
		<li>For å få en liten mengde jern salt, trykker noen 1 mm granulater av FeSO4•7H2O solid ut på et stykke veie papir, falser du papiret over granulen og knuse det med den flate siden av metall spatula.</li>
		<li>Legge et korn av resulterende pulver til røret protein.</li>
		<li>Vortex å blande og en rosenrød rosa fargen vises i røret.</li>
		<li>Inkuber rosa løsningen protein, landskamper, 10-30 minutter på is. Den rosa fargen vil sakte visne over tid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel filtrering<ol>
<li>Bruke en gel filtrering fullpakket med 10 mL sfærisk polyakrylamid gel med en molekylvekt utelukkelse grense på ca 6000 og mange hydrert partikkel størrelse 90-180 µm i en 1,5 x 12 cm-kolonne, som er utstyrt med en 10 mL-reservoaret. Kontroller kolonnen er utstyrt med nedre og øvre seng støtter i form av 30 um porøse polyetylen diskene til å beholde harpiks i kolonnen og hindre massen kjøres tørr. Montere gel filtrering kolonnen til en ring stå.</li>
		<li>Hvis bruker en pre-pakket gel filtrering kolonne, fjerne hetten og hell av overflødig buffer over øvre seng støtte.</li>
		<li>For å equilibrate kolonnen, kan du begynne med å fylle reservoaret med buffer kompatibel med påfølgende analysen og lagring, for eksempel 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glyserol ved pH 8.0.</li>
		<li>Hvis bruker en pre-pakket gel filtrering kolonne, hektes av nederst spissen av gel filtrering-kolonnen for å starte strømmen av bufferen og utsette Luer skli montering. Passe en stopcock til Luer slip slutten av kolonnen, men la den være åpen og la kolonnen å dryppe av tyngdekraften.</li>
		<li>Når bufferen har drenert fra kolonnen og øvre seng støtte er utsatt, lukke stopcock, og legge det ~ 3 mL av Fe (II) rekonstituert metalloenzyme kolonnen av pipettering løsningen på utsatte øvre seng støtte.</li>
		<li>Åpne stopcock og la hele 3.0 mL prøven inn kolonnen av tyngdekraften. Kast disse første 3 mL eluent. Rosa farger som danner under behandling av løsningen vil bli fanget på toppen av kolonnen.</li>
		<li>Når kolonnen har stoppet dryppende og øvre seng støtte er utsatt, legge 4 mL gel-filtrering bufferen (f.eks 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glyserol ved pH 8.0) til kolonnen. Åpne stopcock og samle eluent i microcentrifuge rør over åtte 0,5 mL fraksjoner.</li>
		<li>Teste fraksjoner for protein bruker kolorimetrisk protein analysen eller UV-Vis27,28 som beskrevet tidligere.</li>
		<li>Kombinere protein inneholder brøker.</li>
		<li>Trekke en prøve for SDS side analyse26.</li>
		<li>Fortsett med analysen eller lagring av prøven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hochuli, E., Bannwarth, W., D&#246;beli, H., Gentz, R., St&#252;ber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Approach+to+Facilitate+Purification+of+Recombinant+Proteins+with+a+Novel+Metal+Chelate+Adsorbent.">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li><li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization.">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Biochemistry. , (1999).</li><li>Boyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).</li><li>le Maire, M., Chabaud, R., Herv&#233;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).</li><li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).</li><li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+chromatography+of+lactate+dehydrogenase:+An+experiment+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).</li><li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+milk+whey+&#945;-lactalbumin+by+immobilized+metal-ion+affinity+chromatography.">Purification of milk whey &#945;-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).</li><li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+mutation+to+protein+characterization.">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li><li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students:+An+illustration+of+protein+expression+and+purification*.">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li><li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li><li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education.">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li><li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protein+chemistry+laboratory.">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li><li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi.">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li><li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+writing-intensive,+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates.">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li><li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization:+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase.">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Known+structure,+unknown+function:+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course.">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li><li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes:+Use+of+Recombinant+Protein+Expression+and+Affinity+Tags+to+Aid+Identification+of+Native+Metal+Ion+Cofactors.">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry &amp; Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li><li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes.">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li><li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallo-Enzymes+and+Metallo-Proteins,+Chemistry+of.">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li><li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins+Using+the+pET+System.">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradford+Protein+Assay.">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Quantitation.">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li><li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li><li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+overexpression,+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2,3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum.">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li><li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li><li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis:+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition.">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li><li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification+and+properties+of+2,3-dihydroxyphenylpropionate+1,2-dioxygenase+from+Escherichiacoli.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li><li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2,3-Dihydroxyphenylpropionate+1,2-Dioxygenase+(MhpB).">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li><li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246,+His-199,+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2,3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1.">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li><li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC,+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase.">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li><li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ingen avsløringer.

Mens tillegg av polyhistidine tags rekombinante proteiner og rensing av IMAC har blitt nesten allestedsnærværende i biokjemiske litteratur3,4,5, anvendelser av IMAC til enzym rensing i biokjemi undervisning laboratoriet være sparsom og publiserte metoder ikke alltid vurdere ressurs begrensninger av undervisningen laboratorium20. Videre er bruk av IMAC i undervisning laboratoriet mest effektivt når koplet til eksperimenter som vurderer aktivitet og renhet, gjør IMAC rensing av et enzym en ideell instruksjonssøster aktivitet. For å utvide bruken av IMAC til rensing av enzymer, inkludert metalloenzymes, i undervisning laboratoriet, er pålitelig og rimelig metoder nødvendig. Denne protokollen, vi viser Borstemmaskin IMAC med lett tilgjengelig og rimelig laboratorium forsyninger, mens adressering også begrensningene i anvendelsen av IMAC til metalloproteins22, ved gjenoppbygge iron(II) avhengige metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, legge rensing. Ved hjelp av reagenser og materiale, anslå vi kostnaden for forbruksvarer for åtte studentgrupper er mellom $500-600 per semester kjøre denne protokollen, inkludert analyse fremgangsmåten i figur 1 og figur 2.
På grunn av brukervennlighet som Fe2 + kan dissociate fra aminosyre ligander24 og lettvinte oksidasjon av Fe2 + O2 til Fe3 +, rekonstituering av ikke-måltema, er aminosyre-chelated iron(II) i en rekombinant metalloenzyme en typisk komponent i enzym rensing. Når klassisk kromatografi brukes, er det mulig å unngå totalt tap av jern i noen tilfeller32, men oftere, jern (II) legges tilbake i nærvær av reduksjonsmidler33,34,35, 36 ofte under en anaerob atomosphere37,38,39, og i noen tilfeller overflødig jern ikke fjernet33,34,36, kompliserer alle påfølgende analysen. Påfølgende trinnene i klassisk kromatografi og en anaerob atmosfære er ikke realistisk for undergraduate laboratoriet, spørre utviklingen av denne protokollen.
Mens manuelle utarbeidelsen av kolonnen Ni-NTA og behandling av prøver hovedsakelig av tyngdekraften tar ekstra tid og innsats når sammenlignet med ferdigpakkede spalter og automatisert kromatografi instrumentering, tillater manuelle trinn for praktisk lære av studenten som resulterer i økt forståelse av vitenskapen bak prosessen. Tillegg av en jern (II) salt under forholdene som er beskrevet her er spesielt følsomme for overflødig dithiothreitol. Hvis en student ved en feiltakelse legger et overskudd av dithiothreitol, trolig en nedbør hendelse. Vi har funnet det nyttig å krever studentene til å utføre beregninger av reagens mengder før ankomst i laboratorium, slik laboratorium tid kan brukes mest effektivt på benken. Hele Borstemmaskin IMAC rensing - fra celle-lysis til protein elueringsrør - kan oppnås i en 4-timers laboratorium periode, etterfulgt av rekonstituering og analysen i en etterfølgende lab.

De første rapportene om rensing av en polyhistidine merket protein fra ekstrakter av en vert organisme med chelation i histidin koden ved en immobilisert metall inn litteraturen i 19881,2. Siden den gangen, tillegg av polyhistidine tags rekombinante proteiner og rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) har blitt nesten allestedsnærværende i biokjemiske litteratur3,4, 5. IMAC rensing metoder kan implementeres på Borstemmaskin, bruke automatiserte kromatografi og i spin-kolonne-format. Mens affinitet rensing metoder, spesielt IMAC, er mye brukt i forskningslaboratoriet, er de mindre vanlig i undervisning undervisning laboratoriet. Mest brukte laboratorium lærebøker for biokjemi laboratoriet lære ikke rutinemessig disse metodene, i stedet velger mer tradisjonelle ion-exchange eller fargestoff-bindende kromatografi6,7,8 , 9. For eksempel rensing av laktat dehydrogenase av Anderson10 bruker affinitet av fargestoff-bindende, og rensing av bovin melk α-lactalbumin7,11 av Boyer bruker et nikkel-nitriloacetic Acid matrix, men ingen rekombinant poly-histidin kode, stoler i stedet på iboende affinitet av protein for harpiks. Noen moderne undergraduate laboratoriet lærebøker og publikasjoner gjøre gjennomføre immobilisert metall affinitet Ture på poly-histidin merket protein mål som grønn eller rød-fluorescerende proteiner12,13, 14,15, antistoffer16og valgte enzymer17,18,19,20, selv noen ukjent funksjon21. Uten tvil, rensing av et enzym er å foretrekke i undervisning laboratoriet, fordi målet kan være assayed for aktivitet i etterfølgende økter, berikende opplevelsen av "ekte vitenskap" av studenten; faktisk slike laboratorium opplevelser har blitt publisert og resultater på elevenes læring rapporterte17,18,20,21. Og ennå, anvendelser av IMAC til enzym rensing i biokjemi laboratoriet være sparsom, og publiserte metoder kan selv antar tilgang til kromatografi instrumentering som er vanligvis ikke tilgjengelig for bruk i klasserommet laboratoriet 20. det er også begrensninger i bruk av IMAC til metalloproteins, spesielt de som binder redoks-sensitive divalent metaller som er viktige for aktivitet22. Ofte er metall ion mistet eller oksidert under renselsen gir en inaktiv enzym dårlig tilpasset undergraduate laboratoriet.
En full tredjedel av enzymer binde en metall ion23, og til tross for en nesten universell kravet for jern i alle former for liv23, jern er uten tvil blant de mest problematisk metall ionene i enzymology. Non-måltema Fe2 + bindende enzymer er spesielt utsatt for tap og/eller oksidasjon av metall i IMAC; antagelig skyldes mangel på en dedikert organisk ligand som måltema og enkel med hvilke Fe2 + kan dissociate fra aminosyre ligander24. Videre er oksygen avhengige oksidasjon av Fe2 + til Fe3 + spontan vandig løsning, negative fri energi endringen og relativ stabilitet Fe3 +. Ofte er disse utfordringene overvunnet ved hjelp av anaerob atmosfære og/eller ikke-IMAC brukt kromatografiske metoder22. I denne artikkelen vil vi vise bruk av Borstemmaskin IMAC å rense den Fe2 + avhengige metalloenzyme L-DOPA dioxygenase ved hjelp av enkle, rimelige kromatografi forsyninger, etterfulgt av rekonstituering av det aktive området Fe2 +, og enzymatisk analysen. Disse metodene er standard i vår egen undervisning biokjemi laboratorium for 6-12 studentgrupper og kan brukes til å utvide repertoaret enzym undersøkelser på lavere nivå.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC), polyhistidine merket proteiner er lett mestrer av studenter og har blitt den mest brukte protein rensing metoden i moderne litteratur. Men anvendelsen av affinitet kromatografi metall binding proteiner, særlig de med redoks følsom metaller som jern, er ofte begrenset til laboratorier med tilgang til en hanskerommet - utstyr som ikke rutinemessig i lavere laboratoriet. I denne artikkelen viser vi vår Borstemmaskin metoder for isolasjon, IMAC rensing og metall-ion rekonstituering av en poly-histidin merket, redoks-aktive, ikke-heme jern bindende extradiol dioxygenase og analysen av dioxygenase med variert substrat konsentrasjoner og Mette oksygen. Disse metodene er utført av studenter og implementert i undervisning undervisning og forskning laboratorium med instrumentering som er tilgjengelig og rimelig på hovedsakelig lavere institusjoner.

Disse representant resultatene ble samlet av studenter som de henrettet denne protokollen i to kurs laboratorium perioder med BCM 341: eksperimentell biokjemi ved Muhlenberg College. Figur 1 viser resultatene av rensing av en 20 kDa poly-histidin merket metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, som utføres av to studenter i en 4-timers klasserommet laboratorium periode og analyseres av SDS side av samme studenter i en etterfølgende laboratorium periode. Poly-histidin merket protein er renset (figur 1, lane 2). En immunoblot av gel med antistoff mot poly-histidin koden indikerer at en liten mengde poly-histidin merket målet protein er tapt i gjennomflytsenhet (data ikke vist), sannsynligvis fordi mer enn 100 mg mengde mål protein i den lysate overskredet innbindingen behandlingskapasitet av harpiks.
Figur 2 viser student samlet aktivitetsdata på den enzymatiske reaksjonen av poly-histidin merket metalloenzyme målet, L-DOPA dioxygenase, etter rekonstituering med jern (II) og påfølgende gel-filtrering som beskrevet av protokollen her. Fem andre døde-tid før data samlet inn begynner er typisk for studenter utfører denne teknikken for første gang. Robust aktiviteten til metalloenzyme ble oppdaget bruker en publisert analysen, og gitt stabil kinetic parametere samsvar med publiserte resultatet29. Stabil kinetic parametere ble fastsatt av passende fremgang kurver30 vist i figur 2; ikke-lineære minste kvadraters montering av første samlet over en rekke substrat konsentrasjoner er imidlertid like mulig31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figur 1. SDS side26 analyse av poly-histidin merket protein før, under og etter rensing. Baner 1 - molekylvekt markører, 2-renset protein (20 kDa) innlegget Ni-NTA, 3-Ni-NTA strømme gjennom, 4 - cellen gratis råolje ekstrakter før rensing, 5 - celle-rusk pellet innlegget lysis. Eksempler ble tilberedt med 5 x prøve/lasting buffer og skilt på sandsekk 4-20% polyakrylamid gels bruker gel geleelektroforese system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figur 2. Steady state analysen av jern (II) rekonstituert metalloenzyme (dvs. L-DOPA dioxygenase, 10µM) med substrat (L-DOPA-5 µM (rød), 25 µM (grønn), 50 µM (blå)) i bufferen (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8). Spor viser produktet formasjon på 414nm. Absorbansen data anskaffet kontinuerlig med 1 mL methacrylate cuvettes i en split-beam skanning UV-synlig spectrometer29. Rådata er egnet til en modell av Michaelis-Menten stabil tilnærming (KM 30,8 µM ± 14.4, kkattentilsynelatende . 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Her presenterer vi en protokoll for Borstemmaskin immobilisert metall affinitet kromatografi rensing og påfølgende rekonstituering av en polyhistidine merket, ikke-heme jern bindende dioxygenase egnet for undervisning undervisning laboratoriet.

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet Ture, rekonstituering og analysen av en Polyhistidine merket Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step berikelse av en TAP-Tagged Histone deacetylase av trådformede sopp Aspergillus nidulans for enzymatisk aktivitet analysen

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktivert tverrbundet Agarose for den raske utviklingen av affinitet kromatografi harpikser-antistoff fangst som en Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...