Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Esta publicação é baseada em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no.  CHE 1708237.

1. preparação para a purificação
<ol><li>Preparação do extrato bruto sem célula<ol>
<li>Obter um centrifugado ~ 9-10 g de Escherichia coli (BL21) que overexpressed Metaloproteína polyhistidine marcado25 em um tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Adicione 5 mL por grama de tampão de Lise temp/bind de quarto (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) para a ~ 9-10 g de centrifugado para um volume total ~ 45-50 mL. Periodicamente o vórtice para incentivar a dissolução. Se o pellet foi congelado, descongele em banho de água morna.</li>
		<li>Utilizando banho de gelo, esfriar a suspensão de células para ~ 3 ° C, em preparação para a lise celular. Nota: Neste ponto, lise celular por sonication, trituração de grânulo ou outro método é possível. Trituração do grânulo é demonstrada aqui porque é rápido, relativamente barato e não exige proteção de orelha.</li>
		<li>Monte um grânulo de 50ml moagem câmara de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Encha a câmara de moinho do grânulo meio cheio de refrigerados 0,1 grânulos de vidro de mm que foram armazenados a-20 ° C.</li>
		<li>Preencher o restante da câmara com a suspensão de eritrócitos refrigerados e usar o tampão de Lise/bind de 4 ° C para encher a câmara completamente.</li>
		<li>Use uma espátula pequena para girar o eixo do moinho do grânulo e a suspensão de células se misturam com os grânulos.</li>
		<li>Remover quaisquer bolhas grandes com uma pipeta e em seguida Atarraxe a tampa.</li>
		<li>Seque a câmara de fugas.</li>
		<li>Adicionar cerca de 1 xícara de gelo para a jaqueta clara, plástica, inverter a câmara preenchida 50 mL para a jaqueta cheia de gelo e parafuso fechado.</li>
		<li>Fixe a câmara de gelo-encamisado no motor.</li>
		<li>Transformar o moinho do grânulo motor por 15 segundos a 15.800 rpm e, em seguida, deixe para descansar por 45 segundos. Repita 8 vezes.</li>
		<li>Quando os 8 ciclos completos, decante a suspensão de lise de toda a célula para uma de 50 mL ou maior tubo de centrifugação de alta velocidade (25.000 x g ou superior). Coloca um par de tubos equilibrados na centrífuga e girar a 25.000 x g por 40-45 minutos a 4° C para granular célula grânulos de detritos e vidro. Nota: Se 50 mL ou tubos de maiores Pontuação: para centrifugação de alta velocidade não estiverem disponíveis, retire os grânulos de vidro por centrifugação a 1000 a 2000 x g por 2-3 min em um tubo cônico de 50 mL para produzir um volume menor de suspensão de células (~ 25 mL) que pode ser decantado para um menor volum tubo e avaliado por centrifugação de alta velocidade.</li>
		<li>Quando centrifugação é completa, decante os extratos claros, amarelos, sem célula, brutos em um tubo cónico de 50ml limpo. Tome cuidado para não transferir quaisquer detritos de células.</li>
		<li>Colete uma pequena amostra dos extratos brutos sem célula para posterior análise da purificação por SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da coluna IMAC<ol>
<li>Obter uma coluna de 1,5 x 20 cm, equipada com um suporte inferior da cama para reter as partículas de resina, uma tomada de fechamento de Luer e uma tampa superior que também contém um encaixe de Luer lock. Encaixe na tomada do conector Luer-lock com uma torneira de passagem para controlar o fluxo.</li>
		<li>Trabalhando para a bancada, firmemente monte a coluna em uma posição de anel.</li>
		<li>Obter uma pasta de 50% de resina de (Ni-NTA) ácida nitriloacetic níquel-limite em 20% de etanol foi armazenado a 4 ° C.</li>
		<li>Agite suavemente o frasco para uniformemente Ressuspender a resina.</li>
		<li>Trabalhando em temperatura ambiente- e sobre a bancada, uso estabeleceu-se uma pipeta graduada para retirar 2 mL do chorume, que renderá 1 mL de resina capaz de ligação 50-60 mg de polyhistidine tagged proteína e transferir o chorume para a coluna.</li>
		<li>Abra a torneira e deixe a solução de armazenamento em excesso para drenagem por gravidade da resina.</li>
		<li>Fechar a torneira com segurança</li>
		<li>Usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente adicionar tampão de Lise/bind refrigerados (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) e a coluna de resina – pelo menos 30 mL. Tome cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
		<li>Equilibrar a resina, permitindo que o buffer de Lise/bind drenar lentamente da coluna por gravidade para um copo de coleção.</li>
		<li>Quando o tampão de Lise/bind principalmente drenou, fechar a torneira para interromper o fluxo de buffer quando ~ 5 mL de tampão de Lise permanece acima da resina e deixar a coluna, montada na vertical, até que esteja pronto para continuar, ou por até 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação do alvo Polyhistidine-marcados por IMAC
<ol><li>Prepare o tampão de lavagem (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, pH 8 do imidazole de 20 mM) e o tampão de eluição (50mm fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol 250 mM, pH 10% glicerol 8). Relaxar a 4° C.</li>
	<li>Prepare a coluna do Ni-NTA para a adição dos extratos brutos sem célula, abrindo a torneira e permitindo que o restante de tampão de Lise/ligação para drenagem por gravidade através da resina Ni-NTA. Quando drenou toda a reserva, e a superfície da resina é exposta, feche a torneira.</li>
	<li>O bruto grátis celular usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente pipeta extrai para a resina, tomando cuidado para não perturbar a superfície. Execute os extratos brutos as paredes da coluna para evitar salpicos. O volume de extratos brutos aplicado é dependente do nível de expressão da proteína polyhistidine-tag; assegurar que o volume total de extratos crus contém 50-60 mg ou menos de proteína alvo por mL de resina Ni-NTA (consulte a etapa 1.2.4).</li>
	<li>Quando todos os extratos brutos foram transferidos para a coluna, abra a torneira para que a coluna pode drenar por gravidade. Este fluxo através de é composto por proteínas que se não ligam para a resina – coletar 100 μL para posterior análise da purificação por SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>A viscosidade dos extratos brutos sem célula pode diminuir o fluxo de gravidade da coluna consideravelmente. Para aumentar a taxa de fluxo, aplica um simples "mão-bomba":<ol>
<li>Pegue uma seringa de 10ml Luer-lock e conectá-lo à tampa da coluna usando um comprimento curto de tubo plástico e encaixes Luer-lock entre a tampa de coluna e a seringa. Retire o êmbolo da seringa e em seguida, encaixar firmemente a tampa da coluna na parte superior da coluna.</li>
		<li>Comprima suavemente o êmbolo da seringa enquanto manualmente, avaliar a taxa de fluxo através da recolha de eluente em um cilindro graduado; taxas de 1 a 2 mL por minuto são compatíveis com a resina e esta configuração. Delicadamente aumente a compressão do êmbolo da seringa como retarda a taxa de fluxo.</li>
		<li>Para evitar a introdução de ar na resina, retire a tampa da coluna anexado bomba manual quando o menisco do líquido aplicado atinge 5 a 10 mm acima da cama de resina e permitir que o volume restante para drenagem por gravidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando os extratos brutos livre de célula tem terminado a drenagem e a superfície da resina é exposta novamente, use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de lavagem refrigerado à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
	<li>Abra a torneira e permitir que o tampão de lavagem drenar através da coluna. Este processo é remover proteínas fracamente acopladas da resina. Descarte o eluente.</li>
	<li>Enquanto o tampão de lavagem está drenando, preparar dezesseis, rotulado, microcentrifuga tubos para a coleta de frações de 1 mL.</li>
	<li>Quando o tampão de lavagem tem drenado e a superfície da resina é exposta novamente, feche a torneira. Use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de eluição refrigerados à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
	<li>Abra a torneira lentamente e permitir que o buffer de eluição para eluir a proteína polyhistidine marcado da coluna. Colete 1 mL de eluente em cada um dos tubos microcentrifuga marcado, 1 a 16.</li>
	<li>Teste as frações de proteínas usando o reagente e/ou instrumento fabricantes27,28um ensaio colorimétrico proteína tais como o ensaio de Bradford ou espectroscopia UV-visível de acordo com os métodos específicos. Como mostrado aqui, o ensaio colorimetric usando azul de Coomassie é reduzido a um volume de 100 μL para sacrificar apenas um pequeno volume de cada fração.</li>
	<li>Mix 3 μL de cada fração com 100 µ l de uma proteína colorimétrica do ensaio reagente e manualmente, observar a formação de qualquer cor para indicar a presença de proteína na fração; detecção com um espectrômetro não é necessária.</li>
	<li>Se a proteína é encontrada na fração 16, continue farmacológicos frações de 1 mL e ensaio para proteína periodicamente, até as frações eluted já não contêm uma quantidade significativa de proteína.</li>
	<li>Combinar proteína contendo frações em um tubo limpo cônico e retirar uma amostra de 100 μL para posterior análise por SDS-PAGE26.</li>
	<li>Prosseguir com a reconstituição do cofactor do íon do metal ou congelar a proteína em alíquotas de 3 mL a-80 ° C. Certifique-se que 10% de glicerol é incluído na eluição buffer é um crioprotetor para estabilizar a proteína pura durante o congelamento.</li>
	<li>Quando a eluição da coluna Ni-NTA é completa, ou seja, toda a proteína é a coluna e recolhidos em frações, passar outro 25 mL de tampão de eluição através da coluna e armazenar a coluna a 4 ° C em ~ 5 mL de tampão de eluição para armazenamento a curto prazo , ou tampão de Lise/bind com 20% de etanol para o armazenamento de longo prazo.</li>
</ol>3. reconstituição da proteina alvo com Fe2 +
<ol><li>Adição de Fe2 + Nota: Necessita de um ferro não-heme (II) vinculação da enzima, tais como a l-dopa dioxigenase neste exemplo, um íon2 + Fe para atividade; no entanto, o ferro (II) oxida prontamente ao ferro (III), que está inativo, e uma fração da proteína purifica sem qualquer ferro em tudo.<ol>
<li>Para iniciar a reconstituição do metal, obter 3 mL da enzima purificada suspendida em tampão de eluição. Se congelado, descongelar rapidamente através de um banho de água morna e uma vez descongelado, coloque a proteína no gelo.</li>
		<li>Usando o volume de proteína no tubo, calcule a quantidade de ascorbato de sódio (198.1 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra. Além disso, calcule a quantidade de ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra.</li>
		<li>Adicione o ascorbato de sódio sólido e TDT e suavemente, mas completamente, misture até para dissolver completamente. Tome cuidado para não causar precipitação de proteínas com mistura excessivamente agressivo. Adicione uma pequena quantidade de sulfato de ferro (II) hepta (MW 278.01 g/mol) para a amostra de proteína.</li>
		<li>A fim de obter uma quantidade bastante pequena da torneira sal, ferro 1 alguns milímetros grânulos de Filipa4•7H,2O sólido para fora em um pedaço de papel de pesar, dobram o papel sobre o grânulo e esmagá-lo com o lado liso de uma espátula de metal.</li>
		<li>Adicione um grão do pó resultante para o tubo de proteína.</li>
		<li>Vórtice de misturar e uma rosa cor-de-rosa aparecerá no tubo.</li>
		<li>Incube a solução-de-rosa da proteína, tampada, por 10-30 minutos no gelo. A cor rosa vai desaparecer lentamente ao longo do tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtração de gel<ol>
<li>Use uma coluna de filtração de gel embalada com 10 mL de gel de poliacrilamida esférico com um limite de exclusão de peso molecular de aproximadamente 6.000 e uma variedade de tamanho de partícula hidratado de 90 – 180 µm em uma coluna de 1.5 x 12 cm, que também é equipada com um reservatório de 10 mL. Certifique-se a coluna está equipada com o mais baixo e oferece suporte a cama superior sob a forma de 30 discos de polietileno poroso hum para reter a resina na coluna e impedir a cama de resina seco executado. Monte a coluna de filtração de gel para uma posição de anel.</li>
		<li>Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, retire a tampa e despeje o buffer excesso acima do apoio da cama superior.</li>
		<li>Para equilibrar a coluna, comece por encher o reservatório com buffer compatível com subsequente do ensaio e armazenamento, por exemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0.</li>
		<li>Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, arrancar a ponta inferior da coluna de filtração de gel para iniciar o fluxo de buffer e expor o encaixe de deslizamento de Luer. Caber uma torneira de passagem para o fim de deslizamento de Luer da coluna, mas deixá-la aberta e permitir que a coluna a escorrer pela gravidade.</li>
		<li>Quando o buffer tem drenado da coluna e o apoio de cama superior é exposto, fechar a torneira e adicionar o ~ 3 mL de metalloenzyme o Fe (II) reconstituído à coluna pipetando a solução sobre o suporte da cama superior exposta.</li>
		<li>Abra a torneira e permitir que a amostra inteira 3,0 mL inserir a coluna por gravidade. Descarte esses primeiros 3 mL de eluente. Qualquer cor de rosa que se forma quando manusear a solução ficará preso no topo da coluna.</li>
		<li>Quando a coluna parou de pingar e o apoio de cama superior é exposto, adicione 4 mL de tampão de gel filtração (por exemplo, 50mm NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0) para a coluna. Abra a torneira e coletar o eluente em tubos microcentrifuga sobre oito fracções de 0,5 mL.</li>
		<li>Teste as frações de proteína usando um ensaio colorimétrico da proteína ou UV-Vis27,28 , conforme descrito anteriormente.</li>
		<li>Combine proteína contendo frações.</li>
		<li>Retire uma amostra para análise de SDS-PAGE26.</li>
		<li>Prosseguir com o ensaio ou armazenamento da amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Os autores têm sem divulgações.

Enquanto a adição de tags de polyhistidine para proteínas recombinantes e sua purificação por IMAC tornou-se praticamente onipresente na literatura bioquímica3,4,5, aplicações de IMAC para purificação da enzima na bioquímica, laboratório de ensino permanecem esparsas e métodos publicados não considera sempre as limitações de recursos do ensino de laboratório20. Além disso, o uso do IMAC no laboratório de ensino é mais eficaz quando acoplado a experimentos que avaliam a atividade e pureza, fazendo a purificação do IMAC de uma enzima de uma atividade instrucional ideal. A fim de alargar a aplicação do IMAC para a purificação de enzimas, incluindo metaloenzimas, no laboratório de ensino, são necessários métodos confiáveis e baratos. Neste protocolo, demonstramos benchtop IMAC usando fontes de laboratório prontamente disponíveis e baratos, ao abordar também as limitações na aplicação do IMAC para metalloproteins22, por reconstituir a iron(II) dependente metalloenzyme, l-dopa dioxigenase, postar a purificação. Usando os reagentes e materiais descritos, estimamos que o custo de consumíveis para oito grupos de estudantes é entre 500-600 dólares por semestre para executar este protocolo, incluindo as etapas de análise descritas na Figura 1 e Figura 2.
Devido à facilidade com que Fe2 + pode dissociar aminoácido ligantes24 e a oxidação superficial de Fe2 + por O2 de Fe3 +, reconstituição de não-heme, é aminoácido quelado iron(II) em um metalloenzyme recombinante um componente típico da purificação da enzima. Quando cromatografia clássica é usada, é possível evitar a perda total de ferro em alguns casos,32, mas mais frequentemente, o ferro (II) é adicionado volta na presença de agentes redutores33,34,35, 36 , muitas vezes sob um anaeróbio atomosphere37,38,39e em alguns casos o excesso de ferro não é removido de34,33,36, complicando qualquer ensaio subsequente. Etapas consecutivas de cromatografia clássica e uma atmosfera anaeróbia não são realistas para o laboratório de graduação, solicitando o desenvolvimento do presente protocolo.
Enquanto a preparação manual da coluna Ni-NTA e processamento de amostras em grande parte por gravidade demora adicional tempo e esforço quando comparado com colunas pré-embalados e automatizado de instrumentação de cromatografia, as etapas manuais permitem hands-on pelo aluno que resultam em maior compreensão da ciência por trás do processo de aprendizagem. A adição de um sal de ferro (II) nas condições descritas aqui é particularmente sensível a excesso ditiotreitol. Se um estudante equivocadamente adiciona um excesso de ditiotreitol, um evento de precipitação é provável. Encontrámo-lo útil para exigem que os alunos realizar cálculos de quantidades de reagentes antes de chegar no laboratório, portanto tempo de laboratório pode ser usado mais eficazmente no banco. A purificação de toda bancada IMAC - de lise celular para eluição de proteína - pode ser realizada em um período de 4 horas de laboratório, seguido de reconstituição e ensaio em um período subsequente de laboratório.

Os primeiros relatos da purificação de uma proteína polyhistidine com a tag de extractos de um organismo hospedeiro usando quelante da marca histidina por um metal imobilizado entraram para a literatura em 19881,2. Desde então, a adição de tags de polyhistidine para proteínas recombinantes e sua purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) tornaram-se praticamente onipresente na literatura bioquímica3,4, 5. Métodos de purificação de IMAC podem ser implementados sobre a bancada, usando cromatografia automatizada e em formatos de rotação-coluna. Enquanto os métodos de purificação da afinidade, especialmente o IMAC, são amplamente utilizados em laboratório de pesquisa, eles são menos comuns em laboratório de ensino de graduação. Os manuais de laboratório mais amplamente utilizado para o laboratório de bioquímica rotineiramente não ensinam esses métodos, optando por troca iônica mais tradicional ou corantes cromatografia6,7,8 , 9. por exemplo, a purificação da lactato desidrogenase por Anderson10 usa afinidade por corantes, e a purificação do leite bovino α-lactoalbumina7,11 por Boyer usa um níquel-nitriloacetic matriz de ácido, mas nenhuma marca de poli-histidina recombinantes, confiando preferivelmente em afinidade intrínseca da proteína para a resina. Um moderno laboratório de graduação livros e publicações implementar a cromatografia de afinidade de metal imobilizado em alvos de proteína poli-histidina marcado como proteínas verde ou vermelho-fluorescente12,13, 14,15, anticorpos16e enzimas selecionadas17,18,19,20, até mesmo alguns de função desconhecida21. Indiscutivelmente, a purificação de uma enzima é preferível no laboratório de ensino, porque o alvo pode ser analisado para a atividade em sessões subsequentes, enriquecendo a experiência de "verdadeira ciência" por parte do aluno; na verdade, esses tipos de experiências de laboratório foram publicados e resultados benéficos na aprendizagem do aluno relataram17,18,20,21. E ainda, aplicações de IMAC para purificação da enzima na bioquímica de ensino laboratório permanecem escassos, e os métodos publicados nem podem presumir acesso à instrumentação de cromatografia que normalmente não está disponível para usam em laboratório de sala de aula 20. também há limitações na aplicação do IMAC para pesquisas, especialmente aqueles que se ligam a metais divalentes de redox sensíveis que são essenciais para a atividade22. Frequentemente, o íon metálico é perdido ou oxidado durante a purificação, rendendo uma enzima inativa inadequados para o laboratório de graduação.
Um terço completo de enzimas ligam um íon metálico,23, e apesar de uma exigência quase universal para o ferro em todas as formas de vida23, ferro é, sem dúvida entre os íons metálicos mais problemáticos em Enzimologia. Non-heme Fe2 + ligação enzimas são particularmente propensas à perda e/ou oxidação do metal durante IMAC; presumivelmente devido à falta de um ligante orgânico dedicado como hemo e a facilidade com que Fe2 + pode dissociar aminoácido ligantes24. Além disso, a oxidação dependente do oxigênio de Fe2 + Fe3 + é espontânea em solução aquosa, devido a mudança de energia livre negativa e a relativa estabilidade da Fe3 +. Frequentemente, estes desafios são superados pelo uso de anaeróbios atmosfera e/ou não-IMAC métodos cromatográficos22. Neste artigo, vamos demonstrar o uso de bancada IMAC para purificar o Fe2 + dependentes metalloenzyme l-dopa dioxigenase usando fontes de cromatografia simples, barato, seguidas-se a reconstituição do sítio activo Fe2 +, e ensaio enzimático. Esses métodos são padrão em nosso próprio laboratório de bioquímica graduação de grupos de estudantes de 6-12 e podem ser usados para ampliar o repertório das investigações de enzima na graduação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Cromatografia de afinidade metal de bancada imobilizada (IMAC), de proteínas do polyhistidine com a tag é facilmente dominada por estudantes de graduação e tornou-se o método de purificação de proteínas mais amplamente utilizado na literatura moderna. Mas, a aplicação da cromatografia de afinidade às proteínas de ligação metal, especialmente aqueles com metais sensíveis de redox, tais como o ferro, muitas vezes é limitada a laboratórios com acesso a uma caixa de luva - equipamento que não é rotineiramente disponível nos cursos de graduação laboratório. Neste artigo, demonstramos a nossos bancada métodos para isolamento, purificação e metal-íon reconstituição de um poli-histidina marcado IMAC, ligação de ferro não-heme redox-ativo extradiol dioxigenase e o ensaio do dioxigenase com substrato variado concentrações e saturação de oxigênio. Esses métodos são executados por alunos de graduação e implantados no laboratório de ensino e pesquisa da graduação com instrumentação que é acessível e disponível principalmente de graduação das instituições.

Estes resultados representativos foram coletados por estudantes de graduação como executaram este protocolo durante dois períodos de laboratório curso de 341 BCM: bioquímica Experimental na faculdade de Muhlenberg. A Figura 1 demonstra os resultados da purificação de um 20 kDa poli-histidina tagged metalloenzyme, l-dopa dioxigenase, como realizado por dois alunos de graduação, durante um período de laboratório de sala de aula de 4 horas e analisaram por SDS-PAGE pelo mesmo alunos durante um período subsequente de laboratório. A proteína de poli-histidina marcado é efetivamente purificado (Figura 1, faixa 2). Um immunoblot do gel usando anticorpo contra a tag poli-histidina indica que uma pequena quantidade da proteína alvo poli-histidina marcado é perdida no escoamento (dados não mostrados), provavelmente porque o maior que a quantidade de 100 mg de proteína do alvo na lisado excedeu a capacidade de ligação da resina.
A Figura 2 demonstra os dados de atividade de coleta de estudante na reação enzimática do destino marcou metalloenzyme poli-histidina, l-dopa dioxigenase, após a reconstituição com ferro (II) e gel-filtração subsequente conforme descrito pelo protocolo de neste documento. O segundo de cinco mortos-tempo antes que os dados coletados começa é típico dos alunos executar esta técnica pela primeira vez. A atividade robusta do metalloenzyme foi detectada usando um ensaio publicado e rendeu o estado estacionário de parâmetros cinéticos consistentes com resultados publicados29. Estado estacionário de parâmetros cinéticos foram determinados por encaixe das curvas de progresso30 mostrado na Figura 2; no entanto, não-linear mínimos quadrados encaixe das taxas iniciais recolhidos ao longo de uma série de concentrações de substrato é igualmente possível31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figura 1. Análise de SDS-PAGE26 do poli-histidina etiquetado proteína antes, durante e após a purificação. Faixas 1 - marcadores de Peso Molecular, post 2-purificado da proteína (20 kDa) Ni-NTA, 3-Ni-NTA fluir, 4 - celular grátis extratos brutos antes da purificação, 5 - celular-detritos da pelota post do lysis da. Amostras foram preparadas usando 5 x tampão de amostra/carregamento e separadas em géis de poliacrilamida pre-cast 4-20% usando um sistema de electroforese do gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figura 2. Ensaio de estado estacionário de ferro (II) reconstituído metalloenzyme (i.e., a l-dopa dioxigenase, 10) com o substrato (l-dopa-5 µM (vermelho), e 25 µM (verde), e 50 µM (azul)) no buffer (fosfato de 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8). Traços retratam a formação de produto em 414nm. Dados de absorbância foram adquiridos continuamente usando cubetas de metacrilato de 1 mL na digitalização de espectrômetro UV-visível29, um split-feixe. Dados brutos estão aptos para um modelo de Michaelis-Menten aproximação de estado estacionário (KM 30.8 µM ± 14,4, kgatoaparente 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Aqui nós apresentamos um protocolo para a purificação de cromatografia de afinidade metal benchtop imobilizada e posterior reconstituição de um polyhistidine com a tag, o ferro não-heme vinculação dioxigenase apropriado para o laboratório de ensino de graduação.

Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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Biochemistry

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