Name: benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Denna publikation är baserad på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr  CHE 1708237.

1. beredning för rening
<ol><li>Beredning av det cell-free råa extraktet<ol>
<li>Skaffa en ~ 9-10 g cellpelleten av E. coli (BL21) som de polyhistidine taggade metalloprotein25 i en 50 mL konisk tub i ökad utsträckning.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL per gram rum temp lysis/bind buffert (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol vid pH 8) till ~ 9-10 g av cellpelleten för en total volym ~ 45-50 mL. Med jämna mellanrum vortex att uppmuntra upplösning. Om pelleten var frysta, Tina i ett ljummet vattenbad.</li>
		<li>Med is-vattenbad, chill cellsuspensionen till ~ 3 ° C inför cellys. Observera: Vid denna punkt, cellys av ultraljudsbehandling, pärla fräsning eller en annan metod är möjligt. Bead fräsning demonstreras här eftersom den är snabb, relativt billig och inte kräver hörselskydd.</li>
		<li>Montera en 50 mL pärla fräsning kammare enligt tillverkarens anvisningar.</li>
		<li>Fyll pärla kvarn kammaren halvfull av kylda 0.1 mm glaspärlor som förvarats vid-20 ° C.</li>
		<li>Fyll resten av kammaren med kylda cellsuspensionen och Använd 4 ° C lysis/bind buffert för att fylla kammaren helt.</li>
		<li>Använd en liten spatel att rotera axeln av pärla bruket och blanda cellsuspension med pärlor.</li>
		<li>Avlägsna eventuella stora bubblor med en Pipettera och sedan skruva på locket på.</li>
		<li>Torka av kammaren från läckage.</li>
		<li>Tillsätt ca 1 dl av is till klar, plast jackan, Invertera fyllda 50 mL kammaren i is fyllda jacka och skruv stängd.</li>
		<li>Säkra is-mantlade kammaren på motorn.</li>
		<li>Slå pärla kvarnen motor på i 15 sekunder på 15.800 rpm och låt vila i 45 sekunder. Upprepa 8 gånger.</li>
		<li>När de 8 cyklerna är klara, häll upp hela cellen lysis suspensionen i en 50 mL eller större tub varmt för hög hastighet centrifugering (25 000 x g eller högre). Placera ett par balanserad rör i centrifug och spinn på 25 000 x g för 40-45 minuter vid 4° C till pellet cell skräp och glas pärlor. Obs: Om 50 mL eller större rör varmt för hög hastighet centrifugering inte finns, ta bort glaspärlor genom centrifugering på 1000-2000 x g i 2-3 min i en 50 mL konisk tub att ge en mindre volym av cellsuspensionen (~ 25 mL) som kan xylenet in en mindre volum e tube varmt för hög hastighet centrifugering.</li>
		<li>När centrifugeringen är klar, häll de klara, gula, cell-fri, rå extrakt till en ren 50 mL koniska rör. Se till att inte överföra någon cellfragment.</li>
		<li>Samla ett litet urval av cellfria rå extrakt för senare analys av rening av SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beredning av kolumnen IMAC<ol>
<li>Få en 1,5 x 20 cm kolumn utrustad med ett lägre säng stöd att behålla harts partiklar, en Luer lock utlopp och en övre locket som också innehåller en Luer lock passande. Passa Luer-lock utlopp med en Avstängningskranen att styra flödet.</li>
		<li>Arbetar på bänkmonterade, montera säkert kolumnen ring stativ.</li>
		<li>Få en 50% slurry av nickel-bundna nitriloacetic syra (Ni-NTA) harts i 20% etanol som har lagrats vid 4 ° C.</li>
		<li>Snurra försiktigt på flaskan för att jämnt återsuspendering kådan.</li>
		<li>Arbetar vid rumstemperatur och på bänkmonterade, Använd en graderad Pipettera att dra upp 2 mL av suspensionen, som kommer att ge 1 mL fast harts kan bindande 50-60 mg polyhistidine taggade protein och överföra suspensionen till kolumnen.</li>
		<li>Öppna Avstängningskranen och låta överskottet lagringslösningen rinna av gravitationen från kådan.</li>
		<li>Stäng Avstängningskranen ordentligt</li>
		<li>Använda en Pasteur Pipettera, tillsätt försiktigt kylda lysis/bind buffert (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol vid pH 8) och till kolumnen av harts – minst 30 mL. Se till att inte störa resinytan. Kör bufferten ner väggarna i kolumnen för att förhindra stänk.</li>
		<li>Temperera hartsen genom att låta lysis/bind bufferten rinna långsamt från kolumnen av gravitation till en samling bägare.</li>
		<li>När lysis/bind bufferten har mestadels avrunna, Stäng avstängningskranen för att stoppa flödet av buffert när ~ 5 mL lyseringsbuffert ligger fortfarande över kådan och lämna kolumnen, monteras upprätt, tills redo att gå vidare eller upp till 1 vecka.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rening av Polyhistidine-märkta mål av IMAC
<ol><li>Förbered tvättbufferten (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 8) och eluering buffert (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 10% glycerol pH 8). Chill vid 4° C.</li>
	<li>Förbereda kolumnen Ni-NTA för tillägg av cellfria rå extrakt av öppna Avstängningskranen och låta resterande lysis/bindande buffert rinna av gravitationen genom Ni-NTA kådan. När alla bufferten har runnit och resinytan utsätts, Stäng Avstängningskranen.</li>
	<li>Använda en Pasteur Pipettera, noggrant Pipettera extrakt cell gratis rå på kådan, noga med att inte störa ytan. Kör de rå extrakt ner väggarna i kolumnen för att förhindra stänk. Volymen av rå extrakt tillämpas är beroende av nivån av uttryck av polyhistidine-märkta proteinet; Se till att den totala volymen av rå extrakt innehåller 50-60 mg eller mindre av målproteinet per mL av Ni-NTA harts (se steg 1.2.4).</li>
	<li>När alla rå extrakt har överförts till kolumnen, öppna Avstängningskranen så kolumnen kan rinna av gravitationen. Detta flöde genom består av proteiner som inte binder till harts – samla 100 μL för senare analys av rening av SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>Viskositeten hos de cell-free rå extrakt kan sakta gravitation flödet av kolumnen avsevärt. För att öka flödet, tillämpa en enkel ”handpump”:<ol>
<li>Ta en 10 mL Luer-lock-spruta och Anslut den till den gemensamma jordbrukspolitiken i kolumnen med hjälp av en kort längd på plaströr och Luer-lock kopplingar mellan kolumn GJP och sprutan. Dra ut sprutkolven och sedan tätt passa den kolumn mössa på toppen av kolonnen.</li>
		<li>Försiktigt komprimera kolven i sprutan medan manuellt bedömningen av flödet genom uppsamling eluenten i en graderad cylinder; 1-2 mL per minut är kompatibel med harts och denna setup. Försiktigt öka kompression av sprutkolven flödet saktar.</li>
		<li>För att förhindra införsel av luft till harts, ta bort kolumnen locket och fäst handpump när menisken av tillämpad vätskan når 5-10 mm ovanför harts sängen, och att den återstående volymen rinna av gravitationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När cellen gratis rå extrakt har avslutat dränering och resinytan utsätts igen, använda en Pasteur Pipettera försiktigt lägga till ~ 30 mL kylt tvättbuffert i kolumnen – utan för att störa ytan av kådan. Kör bufferten ner väggarna i kolumnen för att förhindra stänk.</li>
	<li>Öppna Avstängningskranen och låta tvättbuffert rinna genom kolonnen. Denna process tar bort svagt bundna proteiner från kådan. Kassera eluenten.</li>
	<li>Medan tvättbuffert är dränerande, förbereda sexton, märkt, mikrocentrifugrör för att samla in 1 mL fraktioner.</li>
	<li>När tvättbuffert runnit och resinytan utsätts igen, Stäng Avstängningskranen. Använd en Pasteur Pipettera försiktigt lägga till ~ 30 mL kylt eluering buffert i kolumnen – utan för att störa ytan av kådan. Kör bufferten ner väggarna i kolumnen för att förhindra stänk.</li>
	<li>Öppna Avstängningskranen långsamt och låta eluering bufferten till eluera polyhistidine märkta proteinet från kolumnen. Samla in 1 mL elueringslösning i vart och ett av de markerade mikrocentrifugrör, 1 till 16.</li>
	<li>Testa fraktionerna för protein med en kolorimetrisk protein-analys som Bradford assay eller UV-synliga spektroskopi enligt specifika metoder av reagens eller instrument tillverkare27,28. Som visas här, skalas de kolorimetriska analys använder Coomassie blå ned till en 100 μL volym för att offra endast en liten volym från respektive fraktion.</li>
	<li>Blanda 3 μL av varje fraktion med 100 µL av en kolorimetrisk protein assay reagens och observera manuellt bildandet av någon färg för att ange förekomst av protein i fraktionen; detektering med en spektrometer är inte nödvändigt.</li>
	<li>Om protein finns i bråkdel 16, fortsätta eluering 1 mL fraktioner och analysen för protein med jämna mellanrum tills de eluerade fraktionerna inte längre innehåller en betydande mängd protein.</li>
	<li>Kombinera proteinhaltiga fraktioner till en ren konisk slang, och återkalla ett 100 μL prov för senare analys av SDS-PAGE26.</li>
	<li>Fortsätt med beredning av den metall Jon kofaktor eller frysa proteinet i 3 mL alikvoter vid-80 ° C. Se till att 10% glycerol ingår i elueringen buffert är en frysskyddmedel att stabilisera det rent proteinet under frysning.</li>
	<li>När eluering av kolumnen Ni-NTA är komplett, det vill säga allt proteinet är avstängd kolumnen och samlas i fraktioner, passera ytterligare 25 mL eluering buffert genom kolonnen och lagra kolumnen vid 4 ° C i ~ 5 mL eluering buffert för kortsiktig lagring , eller Lys/bind buffert med 20% etanol för långsiktig lagring.</li>
</ol>3. beredning av målprotein med Fe2 +
<ol><li>Tillägg av Fe2 + Obs: En icke-heme järn (II) bindande enzym, såsom den L-DOPA dioxygenas i det här exemplet kräver en Fe2 + Jon för aktivitet; men järn (II) oxiderar lätt till järn (III), som är inaktiva, och en bråkdel av proteinet renar utan järn alls.<ol>
<li>För att börja rekonstitution av metallen, få 3 mL renat enzymet upphängd i eluering buffert. Om frysta, Tina snabbt med hjälp av ett ljummet vattenbad och en gång tinade, sätta proteinet på is.</li>
		<li>Med hjälp av mängden protein i röret, beräkna mängden natriumaskorbat (198.1 g/mol) krävs för att göra slutliga koncentration 12,5 mM i provet. Också, beräkna mängden Ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) krävs för att göra slutliga koncentration 12,5 mM i provet.</li>
		<li>Lägg till solid natriumaskorbat och DTT och försiktigt men grundligt, blanda för att lösa upp pulvret helt. Se till att inte orsaka protein utfällning med alltför aggressiv blandning. Tillsätt en liten mängd järn (II) sulfat heptahydrat (MW 278.01 g/mol) protein.</li>
		<li>För att erhålla en tillräckligt liten kvantitet av järn salt, tap några 1 mm granulat av FeSO4•7H2O solid ut på en bit väger papper, vik pappret över granulat och krossa det med den platta sidan av en metall spatel.</li>
		<li>Tillsätt en nypa resulterande pulvret till röret av protein.</li>
		<li>Vortex att blanda och en ljus rosa färg visas i röret.</li>
		<li>Inkubera rosa lösningen av protein, tak, för 10-30 minuter på isen. Den rosa färgen kommer långsamt blekna med tiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelfiltrering<ol>
<li>Använda en kolumn för filtrering av gel packad med 10 mL av sfäriska Polyakrylamidgelen med en molekylvikt uteslutning gräns på cirka 6000 och hydrerad partikel storlek olika 90 – 180 µm i en 1,5 x 12 cm kolumn, som också är utrustad med en 10 mL reservoar. Se till att kolumnen är utrustad med nedre och övre sängen stöder i form av 30 um porös polyetylen diskar att behålla kådan i kolumnen och förhindra att harts sängen körs torr. Montera kolumnen gel filtrering till en ring stå.</li>
		<li>Om du använder en kolumn för filtrering av färdigförpackade gel, ta av locket och häll bort överflödigt bufferten ovan översäng stöd.</li>
		<li>För att jämvikta kolonnen, börja med att fylla behållaren med buffertlösning kompatibel med efterföljande analys och lagring, till exempel 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol vid pH 8,0.</li>
		<li>Om du använder en färdigförpackade gel filtrering kolumn, Snäpp loss den nedre spetsen av gel filtrering kolumn att starta flödet av buffert och exponera Luer slip tillbehöret. Passar en Avstängningskranen Luer slip ände kolumnen, men lämna den öppen och låt kolonnen droppa av gravitationen.</li>
		<li>När bufferten runnit från kolumnen och översäng stöd är utsatt, Stäng Avstängningskranen och lägga till de ~ 3 mL av den Fe (II) färdigberedd metalloenzyme kolumnen genom pipettering lösningen på exponerade översäng stödet.</li>
		<li>Öppna Avstängningskranen och låta det hela 3,0 mL provet som anger kolumnen självtryck. Kassera dessa första 3 mL av eluenten. Några rosa färg som bildar samtidigt hantera lösningen kommer att svällas överst i kolumnen.</li>
		<li>När kolumnen har slutat droppande och översäng stöd är utsatt, lägga till kolumnen 4 mL gel-filtrering bufferten (t.ex. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol vid pH 8,0). Öppna Avstängningskranen och samla in eluenten i mikrocentrifugrör över åtta 0,5 mL fraktioner.</li>
		<li>Testa fraktionerna för protein med en kolorimetrisk protein assay eller UV-Vis27,28 som tidigare beskrivits.</li>
		<li>Kombinera proteinhaltiga fraktioner.</li>
		<li>Återkalla ett prov för SDS-PAGE analys26.</li>
		<li>Fortsätta med assay eller förvaring av provet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hochuli, E., Bannwarth, W., D&#246;beli, H., Gentz, R., St&#252;ber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Approach+to+Facilitate+Purification+of+Recombinant+Proteins+with+a+Novel+Metal+Chelate+Adsorbent.">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li><li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization.">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Biochemistry. , (1999).</li><li>Boyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).</li><li>le Maire, M., Chabaud, R., Herv&#233;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).</li><li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).</li><li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+chromatography+of+lactate+dehydrogenase:+An+experiment+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).</li><li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+milk+whey+&#945;-lactalbumin+by+immobilized+metal-ion+affinity+chromatography.">Purification of milk whey &#945;-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).</li><li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+mutation+to+protein+characterization.">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li><li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students:+An+illustration+of+protein+expression+and+purification*.">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li><li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li><li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education.">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li><li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protein+chemistry+laboratory.">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li><li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi.">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li><li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+writing-intensive,+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates.">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li><li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization:+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase.">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Known+structure,+unknown+function:+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course.">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li><li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes:+Use+of+Recombinant+Protein+Expression+and+Affinity+Tags+to+Aid+Identification+of+Native+Metal+Ion+Cofactors.">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry &amp; Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li><li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes.">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li><li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallo-Enzymes+and+Metallo-Proteins,+Chemistry+of.">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li><li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins+Using+the+pET+System.">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradford+Protein+Assay.">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Quantitation.">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li><li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li><li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+overexpression,+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2,3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum.">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li><li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li><li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis:+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition.">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li><li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification+and+properties+of+2,3-dihydroxyphenylpropionate+1,2-dioxygenase+from+Escherichiacoli.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li><li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2,3-Dihydroxyphenylpropionate+1,2-Dioxygenase+(MhpB).">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li><li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246,+His-199,+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2,3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1.">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li><li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC,+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase.">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li><li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Författarna har inga upplysningar.

Medan tillägg av polyhistidine taggar till rekombinanta proteiner och deras rening av IMAC har blivit praktiskt taget överallt i biokemisk litteratur3,4,5, tillämpningar av IMAC till enzymet rening i biokemi undervisning laboratorium förbli glesa, och publicerade metoder anser inte alltid resource begränsningar av undervisningen laboratorium20. Dessutom är användningen av IMAC i undervisning laboratoriet mest effektiv när kopplat till experiment att bedömer aktivitet och renhet, att göra IMAC rening av ett enzym en idealisk instruktions aktivitet. För att utvidga tillämpningen av IMAC till rening av enzymer, inklusive metalloenzymes, i laboratoriet undervisning behövs tillförlitliga och billiga metoder. I detta protokoll, visar vi bänkmonterade IMAC med lättillgänglig och billig laboratorium leveranser, samtidigt också ta itu med begränsningarna i tillämpningen av IMAC till metalloproteiner22, genom beredning av järn(II) beroende metalloenzyme, L-DOPA dioxygenas, efter rening. Med hjälp av reagenser och material som beskrivs, uppskattar vi kostnaden för förbrukningsmaterial för åtta studentgrupper är mellan $500-600 per termin att köra detta protokoll, inklusive analys stegen som beskrivs i figur 1 och figur 2.
På grund av den lätthet med vilken Fe2 + kan ta avstånd från aminosyran ligander24 och lättköpt oxidation av Fe2 + av O2 till Fe3 +, beredning av icke-heme, är aminosyra kelaterat järn(II) in en rekombinant metalloenzyme en typisk del av enzymet rening. När klassiskt kromatografi används, är det möjligt att undvika total förlust av järn i vissa fall32, men oftare, järn (II) läggs tillbaka i närvaro av reduktionsmedel33,34,35, 36 ofta under en anaerob miljö37,38,39, och i vissa fall överflödigt järn inte är bort33,34,36, komplicerande eventuella efterföljande analys. På varandra följande steg av klassiskt kromatografi och en anaerob miljö är inte realistiska för grundutbildning laboratoriet, föranledde utvecklingen av detta protokoll.
Även manuell beredning av kolumnen Ni-NTA och bearbetning av prover till stor del av tyngdkraften tar extra tid och ansträngning när jämfört med färdigförpackade kolumner och automatiserad jonkromatografi instrumentering, möjliggör manuella steg praktisk inlärning av studenten som resulterar i ökad förståelse av vetenskapen bakom processen. Tillägg av ett järn (II) salt enligt de villkor som beskrivs här är särskilt känslig för överskjutande Ditiotreitol. Om en elev lägger felaktigt till ett överskott av Ditiotreitol, sannolikt en nederbörd händelse. Vi har funnit att det är bra att kräver studenterna att utföra beräkningar av reagens kvantiteter innan de anländer till labbet, så laboratorium tid kan användas mest effektivt på bänken. Hela bänkmonterade IMAC rening - från cell-Lys att protein eluering - kan åstadkommas i en 4-timmars laboratorium period, följt av beredning och analys under en efterföljande lab.

De första rapporterna av rening av en polyhistidine taggade protein från extrakt av en värdorganism med kelering av taggen histidin genom en immobiliserade metall in litteraturen i 19881,2. Sedan dess har tillägg av polyhistidine taggar till rekombinanta proteiner och deras rening av immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC) har blivit praktiskt taget överallt i biokemisk litteratur3,4, 5. IMAC reningsmetoder kan genomföras på de bänkmonterade, använder automatiserad jonkromatografi och i spin-kolumnen format. Medan affinitet reningsmetoder, särskilt IMAC, används allmänt i forskningslaboratoriet, är de mindre vanliga i grundutbildning laboratorium. De mest använda laboratorium läroböckerna för biokemi laboratorium undervisar inte rutinmässigt dessa metoder, i stället väljer för mer traditionella jonbyte eller dye-bindande kromatografi6,7,8 , 9. exempelvis rening av laktatdehydrogenas av Anderson10 använder affinitet av färgämne-bindning, och rening av mjölk från nötkreatur α-mjölkalbumin7,11 av Boyer använder ett nickel-nitriloacetic sura matrix, men ingen rekombinant poly-histidin-tagg, förlitar sig istället på inneboende affinitet av protein för harts. Vissa moderna grundutbildningsprogram laboratorium läroböcker och publikationer genomför immobiliserade metall affinitetskromatografi på poly-histidin taggade protein mål såsom grön eller röd fluorescerande proteiner12,13, 14,15, antikroppar16och valda enzymer17,18,19,20, även några av okänd funktion21. Utan tvekan, rening av ett enzym som är att föredra i laboratoriet undervisning eftersom målet kan vara analyseras för verksamhet i efterföljande sessioner, berika upplevelsen av ”verklig vetenskap” hos studenten; Ja, dessa typer av laboratoriet upplevelser har publicerats och gynnsamma resultat på elevernas lärande rapporterade17,18,20,21. Och ännu, tillämpningar av IMAC till enzymet rening i biokemi undervisning laboratorium förbli glesa, och publicerade metoderna kan även presumera tillgång till kromatografi instrumentering som inte är vanligtvis tillgänglig för använda i klassrummet laboratoriet 20. det finns också begränsningar i tillämpningen av IMAC till metalloproteiner, särskilt de som binder redox-känsliga tvåvärda metaller som är väsentliga för verksamheten22. Ofta är den metalliska Jon förlorade eller oxideras under reningen ger ett inaktivt enzym dåligt lämpade för grundutbildning laboratoriet.
En full en tredjedel av enzymer binda en metall Jon23, och trots en nästan universellt krav för järn i alla former av liv23, järn är utan tvekan bland de mest problematiska metalljoner i Enzymologi. Icke-heme Fe2 + bindande enzymer är speciellt benägna att förlust och/eller oxidation av metall under IMAC; förmodligen på grund av avsaknaden av en dedikerad organiska liganden som heme och den lätthet med vilken Fe2 + kan ta avstånd från aminosyran ligander24. Dessutom är syre beroende oxidation av Fe2 + till Fe3 + spontana i vattenlösning, på grund av förändringens negativa fri energi och den relativa stabiliteten i Fe3 +. Ofta, övervinns dessa utmaningar genom användning av anaerob atmosfär och/eller icke-IMAC kromatografiska metoder22. I denna artikel, vi kommer att demonstrera användningen av bänkmonterade IMAC att rena den Fe2 + beroende metalloenzyme L-DOPA dioxygenas med enkla och billiga kromatografi leveranser, följt av beredning av den aktiva platsen Fe2 +, och enzymatisk analys. Dessa metoder är vanliga i vår egen grundutbildning biokemi laboratorium av 6-12 studentgrupper och kan användas för att utöka repertoaren av enzymet utredningar på grundnivå.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi (IMAC), av polyhistidine taggade proteiner styras lätt av studenter och har blivit den mest använda protein rening metoden i den moderna litteraturen. Men tillämpningen av affinitetskromatografi på metall bindande proteiner, särskilt de med redox känsliga metaller såsom järn, är ofta begränsade till laboratorier med tillgång till ett handskfacket - utrustning som inte rutinmässigt finns i på grundnivå laboratorium. I denna artikel visar vi våra bänkmonterade metoder för isolering, IMAC rening och metall-Jon beredning av en poly-histidin taggade, redox-aktiva, icke-heme iron bindande extradiol dioxygenas och analysen av dioxygenas med varierande substrat koncentrationer och mättar syre. Dessa metoder är utförda av studenter och genomförs i grundutbildningsprogram undervisning och forskning laboratorium med instrumentering som är tillgängliga och överkomliga vid primärt grundutbildningsprogram institutioner.

Dessa representativa resultat samlades in av studenter som de utförde detta protokoll under två kurs laboratorium perioder av BCM 341: experimentell biokemi vid Muhlenberg College. Figur 1 visar resultatet av rening av en 20 kDa poly-histidin taggade metalloenzyme, L-DOPA dioxygenas, som utförs av två studenter under en 4-timmars klassrummet laboratorium och analyseras av SDS-PAGE av samma studenter under en efterföljande laboratorium. Poly-histidin märkta proteinet är effektivt renad (figur 1, lane 2). En immunoblot gel med antikroppar mot poly-histidin etiketten indikerar att en liten mängd av poly-histidin taggade målproteinet försvinner i genomströmmande (inga data anges), sannolikt eftersom större än 100 mg mängd målproteinet i den lysate överskred den bindande kapaciteten av kådan.
Figur 2 visar student-samlat aktivitetsdata på poly-histidin märkta metalloenzyme målet, L-DOPA dioxygenas, enzymatisk reaktion efter beredning med järn (II) och efterföljande gel-filtrering som beskrivs av protokollet häri. Fem andra döda-tid innan datainsamlingen börjar är typiskt för studenter som utför denna teknik för första gången. Robust aktiviteten av metalloenzyme upptäcktes med hjälp av en publicerade analysen och gav steady state kinetiska parametrar överensstämmer med publicerade resultat29. Steady state kinetiska parametrar bestämdes genom att montera de framsteg kurvor30 visas i figur 2. ickelinjära minstakvadratmetoden montering av ursprungliga priser samlats in över en serie av substrat koncentrationer är dock lika möjligt31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figur 1. SDS-PAGE26 analys av den poly-histidin taggade protein före, under och efter rening. Körfält 1 - molekylvikt markörer, 2-renat protein (20 kDa) post Ni-NTA, 3-Ni-NTA flödet genom, 4 - cell gratis rå extrakt före rening, 5 - cellfragment pellet post lysis. Prover var tillagas med 5 x prov/lastning buffert och åtskilda på förtillverkade 4-20% polyakrylamidgeler med ett gel electrophoresis system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figur 2. Steady state-analysen av den järn (II) ombildade metalloenzyme (dvs L-DOPA dioxygenas, 10µM) med substrat (L-DOPA-5 µM (röd), 25 µM (grön), 50 µM (blå)) i buffert (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8). Spår skildra produkt bildas vid 414nm. Absorbansen data förvärvades kontinuerligt med 1 mL form kyvetter i en split-beam scanning UV-synliga spektrometer29. Rådata är lämpliga till en modell av Michaelis-Menten steady state tillnärmning (KM 30,8 µM ± 14,4, kkattuppenbara 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Här presenterar vi ett protokoll för bänkmonterade orörlig metall affinitet kromatografi rening och efterföljande beredning av en polyhistidine taggade, icke-heme iron bindande dioxygenas lämplig för grundutbildning laboratoriet.

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi, beredning och analys av en Polyhistidine Taggad Metalloenzyme för grundutbildning laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Enstegs berikning av en TAP-märkta Histone Deacetylase av Filamentous svampen Aspergillus nidulans för enzymatisk aktivitet assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ Läkemedelstillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart) test för att studera rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...