Name: amplification of near full-length hiv-1 proviruses for next-generation sequencing
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Эта работа была поддержана Делани предприятие исследования СПИДа (DARE) чтобы найти лекарство (1U19AI096109 и 1UM1AI126611-01); amfAR исследовательский консорциум на искоренение ВИЧ (ARCHE) совместный исследовательский грант от фонда для исследований в области СПИДа (АМФАР 108074-50-RGRL); Австралийский центр по ВИЧ и гепатит вирусологии исследований (ACH2); UCSF-ГИВИ центр исследований СПИДа (P30 AI027763); и австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (AAP1061681). Мы хотели бы поблагодарить д-р Joey лай, менеджер фонда геномики в Westmead институте медицинских исследований для его подготовки в библиотеке подготовки и использования его объекта и Ramaciotti Центр геномики (Университет Нового Южного Уэльса, Сидней, Австралия) для проведения последовательности. Мы с благодарностью признаем участников, кто пожертвовал образцы для этого исследования.

<ol>
	<li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection.">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li><li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4(+)+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants.">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li><li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+position,+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication.">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li><li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure.">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li><li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection.">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li><li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein.">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112 (2003).</li><li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir:+implications+for+eradication.">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4++T+cells.">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li><li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time.">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li><li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection.">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).</li><li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy.">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li><li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple,+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis.">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li><li>. CLC Genomics Version 10 Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench</a> (2018)</li><li>. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li><li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLASH:+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies.">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPAdes:+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing.">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li><li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA7:+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets.">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li><li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7:+improvements+in+performance+and+usability.">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li><li>. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html</a> (2018)</li><li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis.">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li><li>. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018)</li><li>. HIV Sequence Database - Hypermut tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018)</li><li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ggtree:+an+r+package+for+visualization+and+annotation+of+phylogenetic+trees+with+their+covariates+and+other+associated+data.">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Assay сальто является эффективным и высок объём метод для усиления и секвенирования сингл, вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Было выявлено несколько факторов и важные шаги в протоколе, которые влияют на количество и качество полученной последовательности. Во-первых количество клеток и частота ВИЧ-1 инфекции популяции клеток влияет на количество proviruses усиливается. Например, в предыдущей публикации, примерно половина столько последовательностей были получены от такое же количество наивно CD4+ T по сравнению с эффекторных памяти CD4 клеток+ T клетки. Это потому, что наивно клетки, как правило, имеют более низкой частоте инфекции, чем память эффекторные клетки2. Во-вторых лизис клеток является предпочтительным для методов на основе столбца извлечения для получения геномной ДНК, как нет никакого риска потерять ДНК в процессе извлечения. И наконец как и в случае с любой на основе ПЦР анализа, предотвращая загрязнение имеет решающее значение. Раздельный чистых районов должны быть назначены для подготовки мастер смеси, обработка геномной ДНК, добавив позитивные элементы, Очищение дна и количественная оценка и подготовка библиотеки. Это особенно важно для анализов одной копии таких представленных здесь.
Осуществление анализа сальто следует сначала включают запуск положительный контроль таких плазмид pNL4-3, вместо того, чтобы участник образцы. Это позволит для любых неполадок до их использования позитивных клеток ВИЧ-1, как полученные последовательности можно сравнить с последовательности доступны ссылки для этих плазмидов. При использовании положительных клеток ВИЧ-1, важно рассматривать ВИЧ 1 подтип (грунты, предназначенные для сальто являются специфическими для подтипа B) и частота инфицирования популяции клеток, если мало не proviruses усиливаются. Грунтовка последовательности может быть изменен/переработаны, чтобы соответствовать другие подтипы. Кроме того также содержащий положительный контроль должны быть включены в каждую ПЦР выполнена.
САЛЬТО преодолеть ограничения предыдущих анализов виртуализации, включая SPS. Путем усиления и последовательности вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses сальто можно определить потенциальных профессиональных качеств репликации ВИЧ-1 proviruses. Это не было возможно с помощью SPS, который виртуализировать только суб геномных регионов и поэтому выбрали для последовательностей с сайтов связывания primer нетронутыми. Кроме того сальто преодолевает ограничения, связанные с использованием нескольких амплификации и секвенирования грунтовки, как был нанят полнометражных последовательности предыдущих анализов1,4. Через два раунда ПЦР, ориентация в регионах ВИЧ-1 л, в сочетании с NGS сальто уменьшает количество и сложность требует грунтовки. Таким образом, сальто менее подвержен последствия несоответствия грунт, а именно ошибочной идентификации дефектных proviruses и неспособность некоторых proviruses в пределах населения усиливаются. САЛЬТО протокол является также более эффективным и позволяет более высокую пропускную способность по виртуализации чем предыдущие методы.
Очевидно сальто обеспечивает преимущества по сравнению с существующими методами, которые определяют генетический состав ВИЧ-1 proviruses. Однако важно признать ограничения сальто. Во-первых пробирного сальто не разработан как инструмент для измерения размеров скрытых водохранилища ВИЧ-1, как анализы, чтобы определить, является ли сальто усиливает каждый Провирус ВИЧ-1 в популяции клеток еще не завершены. САЛЬТО вместо полезен для относительного сравнения состава водохранилища между различных клеточных популяций2. Во-вторых компетенцию репликации нетронутыми ВИЧ-1 proviruses не может быть определен с точностью без в vivo исследований, таких как выполняемых Хо et al. 4. в-третьих, сальто не предназначен для определения сайта интеграции ВИЧ-1 proviruses.
Незначительные изменения в протоколе сальто может увеличить его применения. Например изменения в грунт, что последовательности можно разрешить различные и несколько подтипов ВИЧ-1 усиливается и виртуализации. Секвенирование вирионов плазмы ВИЧ-1 возможна путем добавления синтеза cDNA до вложенных PCR. Будущего использования методов секвенирования одной молекулы позволит устранить потребность в de novo Ассамблеи.
Генетическое секвенирование комплексной ВИЧ-1 proviruses возросло наше понимание скрытых водохранилища ВИЧ-1. ОТРАЖЕНИЕ является важным инструментом для будущих исследований, изучение состава и распределения латентной водохранилища. Однако применение сальто может выходить за рамки водохранилище. Будущие исследования может использовать отражение для определения конкретных целей для технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas, или помочь в идентификации кодирования и некодирующих регионов, которые делают вирус быстрее реагировать на задержку, вспять агентов. Вирусная Рекомбинация может пониматься лучше, глядя на стыке сайты крупных внутренних исключений.

Генетическая характеристика латентной водохранилища ВИЧ-1, который упорно лиц на долгосрочной антиретровирусной терапии (АРТ), был жизненно важное значение для понимания, что большинство комплексной proviruses являются дефектные и репликации некомпетентность1 , 2. в процессе обратной транскрипции, ошибки вводятся в комплексной proviral последовательность. Некоторые механизмы, которые генерируют дефектных proviral последовательности включают ошибкам-фермента обратной транскриптазы ВИЧ-13, шаблон, Переключение4, и/или APOBEC-индуцированной Гипермутационный5,6. Два недавних исследования обнаружил, что примерно 5% ВИЧ-1 proviruses, изолированные от физических лиц на долгосрочной искусства являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным и может способствовать быстрому отскок в плазме крови ВИЧ-1 при прекращении искусства 1 , 2 , 7. предыдущие исследования выявили, что компетентные репликации ВИЧ-1 proviruses сохраняются в наивной и отдыха памяти CD4+ T клетки подмножеств (включая центральные, переходных и эффекторные клетки памяти T), указывая значение ориентация этих клеток в будущем искоренения стратегии2,8,9.
Ранние идеи в распределение, динамика и поддержание латентной водохранилища ВИЧ-1 были достигнуты за счет использования методов секвенирования сингл proviral (СФМ), генетически характеризуют суб геномных областей генома ВИЧ-110 ,11,12,13. SPS-это универсальный инструмент, состоянии последовательности одного Провирус ВИЧ-1 от в пределах одной инфицированной клетки. Однако СПС не может определить компетенцию репликации proviruses, поскольку он только последовательности суб геномных регионов и промахи proviruses, которые содержат большие изъятия в рамках сайтов связывания праймера. Предыдущие исследования продемонстрировал SPS завышает размер репликации компетентных водохранилище на 13 - 17 раз через избирательно секвенирования нетронутыми суб геномных регионов2.
Для устранения ограничений SPS, Хо и др. 4 и Брунер и др. 1 разработан анализов последовательности вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Это позволило частота генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1 в отдельных лиц на долгосрочной искусства будут определены. Эти анализы усиливается и виртуализации (через Сэнгер секвенирования) суб геномных регионов, которые затем были собраны для получения последовательности (нетронутыми или дефектных) Провирус ВИЧ-1. Три ограничения такого подхода являются: 1) использование нескольких последовательности грунтовки увеличивает риск непреднамеренного включения дефекты в proviral последовательности, 2) грунт несоответствия могут предотвратить усиление конкретных proviruses и 3) часто Вся proviral последовательность не может быть разрешен за счет формальность этих методов.
Чтобы преодолеть ограничения существующих полнометражного анализов proviral Секвенирование ВИЧ-1, мы разработали Full -Лength яндивидуальное Pантиретровирусные Sequencing (ЗЕРКАЛЬНО) assay. ОТРАЖЕНИЕ является секвенирование нового поколения (НГС)-на основе анализа, который усиливает и последовательностей вблизи полнометражный (нетронутыми или дефектных) ВИЧ-1 proviruses высокой пропускной способности и эффективным образом. САЛЬТО обеспечивает преимущества по сравнению с предыдущим анализов, как она ограничивает количество грунтовки использовать; Таким образом это снижает вероятность грунтовка несоответствия, которые могут ограничить численность населения proviruses захватили или непреднамеренно ввести дефекты в Вирусный последовательность. ОТРАЖЕНИЕ является также менее технически сложной, чем предыдущие анализы и включает 6 основных этапов: клетки 1) вызывает лизис инфицированных ВИЧ-1, 2) усиление одного ВИЧ-1 proviruses через вложенные ПЦР на ограничение разрежения с помощью грунтовки, специфичных для высоко сохранены HIV-1 5' и 3' U5 LTR региона (рис. 1а), 3) очистки и количественная оценка усиливается продукции, 4) подготовка библиотека усиливается proviruses NGS, 5) NGS и 6) de novo Ассамблея виртуализированного proviruses для получения Сахалинской каждого Индивидуальные Провирус.
Последовательности, генерируемые сальто может пройти строгий процесс ликвидации определить те из них, которые являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных (рис. 1 c)2. Генетически нетронутыми proviruses отсутствие все известные дефекты, которые привести поколения Провирус репликации некомпетентность. Эти недостатки включают в себя: инверсии последовательностей, большой внутренней удалений, Гипермутационный/пагубное стоп-кодонов, frameshifts или мутации в 5' упаковка сигнала или крупных сращивания донора (MSD) сайта.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Рисунок 1: важнейшие шаги в assay полнометражных последовательности отдельных proviral (ЗЕРКАЛЬНО). (A) ВИЧ-1 ДНК генома с сайтов связывания праймера в 5' и 3' регионах U5 LTR используется сальто для того чтобы усилить вблизи полнометражный (дефектных и нетронутыми) ВИЧ-1 proviruses через вложенные PCR. (B) макет 96-луночных ПЦР пластины, содержащих 80 образца скважин (20 скважин для каждого разведения), 4 отрицательный контроль скважины и 1 положительный контроль хорошо. (C) процесс ликвидации, используемый для идентификации генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Dilute to 5 mM for nested PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AM2548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any 96 well thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4]</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM MgSO4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Desalted. Dilute to (100 M) with H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96M2-HS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Required to seal 96 well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td>
			<td>The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate spinner or benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-GEL 48 1% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G800801</td>
			<td>Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectLoad Wide Range DNA Marker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7058</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother E-Base device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EBM03</td>
			<td>Required for running precast 48 well 1% agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>HS-200</td>
			<td>Heat sealing film for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well 0.8 mL Storage Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0765</td>
			<td>0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP (PCR purification kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM10027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>Required for Nextera XT DNA library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Kit - Illumina/Universal</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td></td>
			<td>Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensistivty DNA kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq Platform</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification of near full-length hiv-1 proviruses for next-generation sequencing

Assay полноразмерные отдельных Proviral виртуализации (ЗЕРКАЛЬНО) является эффективной и высок объём метод, предназначенный для усиления и последовательности сингл, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных), ВИЧ-1 proviruses. ОТРАЖЕНИЕ позволяет определять генетический состав интегрированных ВИЧ-1 в популяции клеток. Путем выявления дефектов в течение ВИЧ-1 proviral последовательности, которые возникают во время обратной транскрипции, например больших внутренних исключений, пагубные стоп-кодонов/Гипермутационный, фреймшифт мутации и мутации/удалений в СНГ выступающих элементов требуется для созревания вириона сальто можно определить комплексный proviruses состоянии репликации. САЛЬТО assay может использоваться для определения ВИЧ-1 proviruses, которые не имеют эти дефекты и поэтому потенциально репликации компетентным. САЛЬТО протокол включает в себя: lysis клеток инфицированных ВИЧ-1, вложенные PCR вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses (с помощью грунтовки, ориентированные на ВИЧ-1 5' и 3' LTR), Очищение дна и количественной оценки, подготовки для виртуализации нового поколения (НГС), NGS, Библиотека de novo Ассамблеи proviral Сахалинской и простой процесс ликвидации для выявления репликации компетентных proviruses. ОТРАЖЕНИЕ предоставляет преимущества над традиционными методами, предназначенных для последовательности интеграции ВИЧ-1 proviruses, таких как сингл proviral последовательности. САЛЬТО усиливает и последовательностей вблизи полнометражные proviruses включение репликации компетентности должен определяться, а также использует меньше амплификации грунтовки, предотвратить последствия несоответствия грунт. ОТРАЖЕНИЕ является полезным инструментом для понимания генетических пейзаж комплексной proviruses ВИЧ-1, особенно в рамках скрытой водохранилище, однако ее использование может распространяться на любое приложение, в котором требуется генетический состав интегрированных ВИЧ-1.

САЛЬТО усиливает и последовательности сингл, вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Протокол включает в себя 6 шагов, чтобы получить вблизи полнометражные proviral последовательности. Эти шаги включают в себя: lysis инфицированных клеток, вложенные ПЦР полнометражный (нетронутыми и дефектных) ВИЧ-1 proviruses, Очищение дна и количественной оценки, секвенирование библиотека подготовки, NGS, и de novo Ассамблеи виртуализированных proviruses. Конце каждого шага можно считать контрольно-пропускной пункт, в котором можно оценить качество продукта (например усиленные ДНК, очищенная ДНК, Библиотека последовательности или последовательности) до следующего шага. Обзор оценки выполняется в конце каждого этапа и ожидаемых результатов приводится ниже.
После вложенных PCR усиленные Продукты запускаются на геле агарозы 1% (рис. 3). Первоначальное качество PCR может определяться инспекции негативные и позитивные элементы. Отрицательный контроль скважины, содержащие усиливается продукт указывают на загрязнение и положительный контроль скважин отсутствует усиливается продукта указывают недостаточный амплификации. Далее Уэллс, содержащие усиливается продукта выбраны для последовательности. Чтобы избежать скважин, содержащие смеси несколько усиленный proviruses, только скважин, содержащие усиливается в конечной точке растворения считаются для виртуализации. Согласно распределения Пуассона концевой разрежения встречается при 30% скважин являются позитивными для усиленные продукта. На этом разрежения, есть 80% шанс эти скважины содержат один Провирус усиливается. Кроме того скважин, содержащий несколько усиленный proviruses разной длины могут быть визуализированы на данном этапе, как несколько полос будет выглядеть на геле. Эти скважины не следует выбирать для виртуализации (рис. 3).
После очистки усиливается proviruses, отобранных для виртуализации количественная оценка гарантирует, что не proviral ДНК теряется на этапе очистки. Если концентрация ДНК усиливается Провирус < 0.2 нг/мкл, оставшиеся образца в PCR2, пластины могут быть очищены. Аналогичный КПП происходит после подготовки Библиотека, в которой каждой отдельной библиотеки количественно. Это гарантирует, что отдельные proviruses были надлежащим образом раздроблена, тегами и усиливается до последовательности. Отдельные proviral библиотеки объединяются в эквимолярных количествах к концентрации окончательный библиотека 4 Нм (или как указано поставщиком последовательности). При слишком низкой концентрации отдельных proviral библиотеки, он может быть исключен из последовательности библиотека бассейн, или отдельные библиотеки подготовленных снова. Окончательная проверка концентрации пуле библиотеки выполняется до последовательности наряду с подтверждающие средняя фрагмент длин.
Контроль качества шаги до стадии Ассамблеи de novo обеспечивает качество чтения, используемый для сборки окончательной proviral contig. Эти шаги включают в себя: Удаление адаптер последовательностей, обрезки 5' и 3' нуклеотидов, ограничение по качеству и игнорируя короткие читает. КГО геномики Workbench может обеспечить контроль качества докладов, которые могут использоваться для оценки первоначального качества читает и руководство обрезки параметры, а затем после определить если обрезки было достаточно для удаления областей низкого качества перед. Кроме того, для Ассамблеи de novo , можно оценить качество собранных Сахалинской на достаточную глубину (> 1000 X) и ровность покрытия (рис. 4A). Смешанным населением также могут быть определены на данном этапе. Смеси нескольких полнометражных (~ 9 kb) proviruses определяются через присутствие нескольких SNPs с частотой более чем на 40%, тогда как смеси коротких (содержащие большого внутреннего исключения) и полнометражные proviruses могут быть идентифицированы по неровной Читайте после сопоставления для полнометражных ссылку же участник (Рисунок 4B) освещение.
В зависимости от приложения окончательное выравнивание могут быть визуализированы с помощью таких инструментов, как ggtree доступны в пакете «R: A язык и среду для статистических вычислений»27. В недавнем исследовании, сальто использовался до последовательности ВИЧ-1 proviruses от наивного, Центральной, переходный и эффекторных памяти CD4+ T клетки изолированы от физических лиц на долгосрочной искусства, с тем чтобы определить если ячейке подмножеств показали выше пропорции генетически нетронутыми и потенциально компетентным репликации ВИЧ-12. Здесь визуальное представление последовательности, изолированный от одного из участников этого исследования (участник 2026) представлен (рис. 5). В этот участник, большинство (97%) последовательностей были дефектных, с нетронутым последовательностей в эффекторных и временной памяти CD4+ T клетки. Этот инструмент визуализации является полезным для показа число последовательностей с большой внутренней удалений и их положение в геноме. Он может Аннотированная далее указать последовательности с пагубным стоп-кодонов, фреймшифт мутации и удаления/мутации в MSD сайта и/или упаковки сигнала.
Одно приложение сальто assay является выявление генетически нетронутыми и потенциально компетентным репликации ВИЧ-1 proviruses. В недавнем исследовании 531 последовательностей, изолированных от CD4+ T клеток из 6 участников на долгосрочный искусства, 26 (5%) генетически нетронутыми proviruses ВИЧ-1 были определены2. Оставшиеся дефектных proviruses относятся с инверсии последовательности (6%), большой внутренней удаления (68%), пагубные стоп-кодонов/Гипермутационный (9%), фреймшифт мутации (1%) и дефекты в упаковке сигнала и/или мутации в узле MSD (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Рисунок 2: Обзор рабочего процесса для de novo Ассамблеи ВИЧ-1 proviruses. Основные шаги рабочего процесса включают: 1) последовательности читать контроля качества, 2) слияние совпадающих пар, 3) Ассамблея de novo и 4) преобразование и консенсуса были красного цвета, синий, зеленый и оранжевый, соответственно. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Рисунок 3: пример геля агарозы ПЦР усиленный proviruses ВИЧ-1. Уэллс, 1, 2, 3, 6, 9 и 10 содержат усиливается proviruses ВИЧ-1. Хорошо 10 содержит Провирус с большой внутренней удаления, хорошо 2 содержит совместного усиления двух ВИЧ-1 proviruses разной длины (смесь), а также 12 содержит положительный контроль. Обратите внимание, что процент скважин, содержащих усиливается продукт – 60%, что выше процент требуется изолировать одно шаблоны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Рисунок 4: пример вывода чтения карт. (A) пример, демонстрирующий даже освещение за счет усиления одного полнометражного Провирус ВИЧ-1. После Ассамблеи de novo все читает сопоставляются собрал contig для создания консенсуса в последовательности. Программная платформа позволяет сопоставленных читает инспекции достаточных и даже освещения. (B) пример, демонстрирующий совместное усиления двух ВИЧ-1 proviruses разной длины (смесь). Чтобы определить смеси, читает сопоставлены последовательность ссылок полнометражный (~ 9 kb) от же участник и читать сопоставления инспекции. Наличие неравномерный охват указывает смесь. Эта цифра воспроизводится с разрешения Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Рисунок 5: Пример визуализации ВИЧ-1 proviral последовательностей, изолированных от CD4+ T клетки подмножеств от индивидуума на долгосрочный искусства. Proviral последовательности отдельных ВИЧ-1 представлены горизонтальными линиями. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Полнометражный отдельных proviral последовательности (ЗЕРКАЛЬНО) предоставляет эффективный и высокопроизводительный метод для амплификации и последовательности Single, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных) proviruses ВИЧ-1 и позволяет для определения их потенциальных возможностей Репликация компетенции. САЛЬТО преодолевает ограничения предыдущих анализов, предназначенных для последовательности латентной водохранилище ВИЧ-1.

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ, такие как определение генетического состава провирусов ВИЧ и различных типов клеток. Особенно выявления тех, которые генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет нам усилить почти всю длину ВИЧ-провирусов из одиночных ВИЧ-инфицированных клеток, а затем последовательности их следующего поколения секвенирования.Для начала подготовьте все буферы, изложенные в текстовом протоколе. Получить клеточные гранулы и добавить сто микролитров буфера лиза на миллион клеток. Смешайте по трубе вверх и вниз.Lyse клетки путем инкубации в тепловой циклер при 55 градусов по Цельсию в течение одного часа, а затем добавить 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Чтобы начать усиливать одиночные провирусы ДНК ВИЧ-1, смешайте реагенты для первого раунда ПЦР, перечисленных в таблице одного из текстовых протоколов. Добавьте 38 микролитров к 85 скважинам в 96 хорошо ПЦР пластины и этикетки этой пластины, как ПЦР 1.После этого перемести пластину ПЦР-1 в четкую область, предназначенную для добавления геномной ДНК. Использование трис-гидрохлорида последовательно разбавляет геномную ДНК из соотношения один к трем в соотношении от одного до 81, убедившись, что подготовить 45 микролитров каждого разбавления. Добавьте два микролитров разбавленной геномной ДНК к каждому образцу хорошо и два микролитера трис гидрохлорида к каждому отрицательному контролю хорошо.Печать всей пластины, за исключением положительного контроля хорошо. Затем переместись в область, предназначенную для добавления положительного контроля. Добавьте два микролитров положительного контроля в соответствующий колодец, а затем полностью запечатайте пластину.Используйте спиннер пластины PCR, чтобы кратко вращать пластину PRC 1 и стягивать любое остаточное содержимое со стороны скважин. Запустите пластину PCR 1 в тепловом циклере, как указано в текстовом протоколе. Затем смешайте реагенты для второго раунда ПЦР, перечисленных в таблице 1.Добавьте 28 микролитров этой смеси PCR 2 к 85 скважинам новой пластины ПЦР 96 скважин. Пометить эту пластину как PCR 2. Используя спиннер пластины, кратко спина ПЦР 1 пластины, чтобы вытащить любое остаточное содержимое со стороны скважин.Добавьте 80 микролитров трис-гидрохлорида к каждой пластине. После этого используйте трубу из мутли-канала для переноса двух микролитров с каждой скважины ПЦР-1 в соответствующие скважины в пластине ПЦР-2. Печать пластины PCR 2 с четким клейкой пленкой.Кратко закрутить пластину PCR 2 в пластине спиннера. Между тем, печать ПЦР 1 пластины с тепловой герметизации пленки для долгосрочного хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Запустите пластину PCR 2 в тепловом циклере, как указано в текстовом протоколе.Затем кратко спина ПЦР 2 пластины стащить любое остаточное содержимое со стороны скважин. Используя многоканарный пипетку, добавьте 60 микролитров трис-гидрохлорида к каждой колодец. Далее, запустить 15 микролитров каждой хорошо на двух 48 хорошо precast один процент агарозы гели, которые содержат бромид этидия.Определите скважины, содержащие усиленный продукт и их приблизительные размеры, и сохраните изображение геля. После этого определите разбавление, при котором не более 30 процентов скважин являются положительными для усиленного продукта. Во-первых, используйте спиннер пластины, чтобы кратко вращать пластину PCR 2 и стягивать любое остаточное содержимое со стороны скважин.Перенесите 40 микролитров из скважин, содержащих усиленный продукт, в соответствующие скважины новой пластины миди на 96 скважин. Далее, изготовить магнитный корм на основе очистки комплект убедившись, чтобы довести магнитные бусы до комнатной температуры и подготовить свежий раствор 80 процентов этанола. Как только шарики достигают вихря комнатной температуры их для того чтобы обеспечить что они тщательно resuspended.Используя многоканарновую пипетку, добавьте 40 микролитров бисера в 40 микролитров усиленного продукта в каждом колодец миди пластины. Смешайте слегка трубы вверх и вниз 10 раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем перенесите пластину на магнитную подстоять и дайте ей отдохнуть в течение двух минут. После этого удалите и отбросьте супернатант. С пластины еще на стенде, мыть бисер, добавив двести микролитров 80 процентов этанола раствор для каждой хорошо.Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 секунд, а затем удалить и отказаться от супернатанта. Повторите этот процесс мытья один раз от добавления этанола к отказу от супернатанта. С помощью многоканаловой пипетки удалите излишки этанола.Дайте бисеру высохнуть в течение 15 минут. После этого снимите тарелку с стенда. Добавьте 30 микролитров буфера elution к каждой хорошо и смешайте путем нежно pipetting вверх и вниз 10 времен.Инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите пластину обратно на магнитную подстоять и дайте ему отдохнуть в течение двух минут. Используя многоканарный пипетку, перенесите 25 микролитров супернатанта в соответствующие скважины новой 96-й скважины ПЦР.Далее используйте спектральный фотометр для определения и записи приблизительной концентрации каждого усиленного продукта ДНК. Установите двойной мель ДНК количественного комплекта и разбавить буфер до одного раза в стерильной ДНК-свободной воды. Добавьте 99 микролитров буфера к соответствующему количеству пустых колодцев в плоской плите культуры нижней ткани.Затем добавьте сто микролитров буфера в три пустые скважины. Для каждого усиленного продукта, который будет измеряться добавить один микролитер очищенной ДНК в тройной к каждому хорошо содержащие буфер. Разбавить лямбду двойной мель ДНК 10 раз от двух нанограмм на микролитер до точки нулевой ноль нанограмм на микролитер для подготовки стандартов.Добавьте сто микролитров каждого двойного стандарта ДНК к трем скважинам. Разбавить флуоресцентный краситель от одной до двухсот с буфером. Быстро добавьте сто микролитров к каждой хорошо, которая содержит образец, пустой или стандартный и перемешать путем трубопроводов вверх и вниз.После этого накройте пластину фольгой, чтобы избежать контакта со светом. Используя считыватель микроплатформ, замечт выбросы флорескции. Используйте записанные измерения для определения концентрации двойной мель ДНК в каждом образце.Затем разбавить каждый очищенный продукт водой до концентрации нулевой точки два нанограмма на микролитер. После вложенных ПЦР, усиленные продукты работают на один процент агарозного геля. Начальное качество ПЦР можно определить путем проверки элементов управления.Поскольку отрицательный контроль, содержащий усиленный продукт, указывает на загрязнение, а положительный контроль без усиления продукта указывает на недостаточное усиление. Только скважины работают в конце точки разбавления, которые содержат одиночные усиленные провирусы рассматриваются для последовательности. Хотя скважины, содержащие несколько усиленных провирусов различной длины, могут быть визуализированы на данном этапе, они не должны быть выбраны для секвенирования.Для сборки de novo качество собранных контигов можно оценить по достаточной глубине и равномерности покрытия. Смешанные группы населения также могут быть определены на данном этапе наличием неравномерного охвата. Визуальное представление последовательностей, изолированных от одного участника, показывает, что 97 процентов их последовательностей являются дефектными.С нетронутыми последовательностями, найденными в effector и переходной памяти CD4 положительные Т-клетки. При попытке этой процедуры важно помнить, что только усиленные продукты, полученные при ограничении разбавления, то есть там, где не более 30 процентов скважин являются положительными, содержат один провирус. После этой процедуры усиленные продукты могут быть секвенированы для определения генетического состава ВИЧ-провирусов.После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области ВИЧ, чтобы изучить распределение генетически нетронутыми ВИЧ-провирусов и различных типов клеток у пациентов на терапии, чтобы определить, где генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных провирусов скрыть. Не забывайте, что работа с ВИЧ-инфицированными клетками может быть опасной и такие меры предосторожности, как ношение соответствующего средства индивидуальной защиты и работа в сертифицированной лаборатории, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...