Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Vi takker Rana Adeel Ahmad for bistand i FCP renseanlæg. Prof. Claudia Büchel er anerkendt for nyttige diskussioner og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfonds til LD (DI1956-1/1) og Humboldt grundlaget for en Feodor-Lynen stipendium til LD.

Bemærk: Fotosyntetiserende komplekser såsom FCPs er yderst sårbare over for lys og varme. Altid arbejde på isen og under en meget svagt lys.
1. isolering af FCP fra celler
<ol><li>
Tylakoid isolation fra C. meneghiniana celler
	<ol>
<li>Vokse C. meneghiniana i fem 500 mL målekolber hver fyldt med 300 mL af ASP-medium23,25 og 50 millioner celler. Tilslut kolber med en prop, bomu...

FCP Liposomer med naturlige lipid sammensætning giver en nem, simpel og reproducerbar værktøj til at undersøge spektroskopiske egenskaber in vitro-. Lipid miljø i FCP Liposomer ligner situationen inden for tylakoid membran, giver anledning til eksperimentelle resultater, der er tættere på naturlige forhold.
Der er flere fordele ved at bruge C. meneghiniana som et modelsystem for FCP antenne. Det vokser forholdsvis hurtigt og er mere robust i forhold til andre diatom mo...

Fotosyntetiske organismer såsom kiselalger skal håndtere skiftende lysforhold og reagere med sofistikerede acclimation mekanismer, at opretholde høje fotosyntetiske effektivitet og beskytte fra foto-oxidative skader forårsaget af overdreven lyset. En større lys-beskyttende proces i fotosyntetiske eukaryoter er høj energi quenching (qE) af absorberet lyset, der forekommer som det vigtigste bidrag til den ikke-fotokemisk quenching (NPQ) under lys stress betingelser1,2 ,3. De lette høst antenne komplekser (LHC) er involveret i reguleringen af excitation energi overførsel veje. Som reaktion på høje lys induceret lav pH i grønkornets lumen, antenne system skifter fra lyset høst tilstand til tilstanden quenching. Denne energi dissipative tilstand beskytter bannersystem (PS) og andre komplekser i tylakoid membran fra foto-oxidation. I fotosyntetiske eukaryoter, er qE normalt forårsaget af to faktorer1,2,3. En faktor er den specialiserede lys høst protein, der reagerer på den lave pH. PsbS protein inducerer qE i højere planter4. LhcSRs5, moduleret af PsbS aktivitet, fremkalde qE i grønalger6. Kiselalger besidder Lhcx-lignende proteiner, som strukturelt relateret til LHCSRs7,8,9,10.
Den anden faktor af qE er den xanthophyll cyklus hvor carotenoider antennen er omdannet til en foto-beskyttende form af de-epoxidation og vendt af epoxidation. I planter og grønalger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger, er diadinoxanthin konverteret til diatoxanthin, som derefter korrelerer med omfanget af NPQ11. Diatom lys høst antenne besidder nogle særheder, selv om det er evolutionær relateret til plante og alge LHCs. Skiftet fra lys høst til foto-beskyttelse er enormt hurtigt og NPQ kapacitet er højere sammenlignet med planter12. Dette kan være en af grundene til hvorfor kiselalger er meget vellykket i forskellige økologiske nicher på en måde, som de er ansvarlige for op til 45% af det oceaniske netto primærproduktion13. Diatom lys høst systemer er derfor et interessant objekt af fotosyntese forskning.
Kiselalger, ligesom de centriske arter Cyclotella meneghiniana, besidder tylakoid iboende lys høst systemer opkaldt efter pigmenter de binde - fucoxanthin, klorofyl (chl) a og c, dermed FCP. lys høst proteiner, såsom FCPs, er indlejret i tylakoid membran system bestående af flere membran lag. Kiselalger danner bands af tre tylakoiderne. Dette kompleks situation gør det vanskeligt at studere dem på det molekylære niveau i tylakoid membran. Desuden, bidrager mange komponenter til reguleringen af lys høst (se ovenfor). Derfor, i mange tilgange, komplekser blev isoleret fra membranen bruge milde rengøringsmidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-Bettinas), som solubilize membranen men holde FCP komplekser intakt. Mange spektroskopiske undersøgelser blev udført ved hjælp af solubilized FCP for at undersøge intramolekylære energi overførsel14,15,16,17. Denne tidligere tilgang var imidlertid begrænset, da forordningen af energioverførsel behov for excitonic interaktion med andre antenne komplekser eller bannersystem. Derfor, disse former for undersøgelser kan ikke foretages med solubilized komplekser fordi samspillet mellem komplekser er tabt.
En vigtig funktion i antenne forordning er "Molekylær fortrængning" af antenne og bannersystem i tylakoid membran18. Tidligere, en enkel tilgang blev udført for at simulere denne effekt in vitro-. Vaskemidlet blev fjernet, hvilket fører til tilfældige sammenlægning af antenne komplekser. Selv om nogle rimelig data er opnået ved denne tilgang17,19, vaskemiddel fjernelse afspejler ikke situationen i vivo og har nogle begrænsninger, da komplekser ikke interagere i deres regelmæssige tertiær struktur.
Brug af Liposomer overvinder flere af de tidligere begrænsninger. Den tertiære struktur er stadig fuldt intakt. Liposom membran giver en kvasi indfødte miljø for antenne komplekser. Membranen adskiller indersiden af Liposom fra omgivelserne. Med disse midler giver Liposomer to reaktion rum for undersøgelser af ion og pH stigninger såvel som for transport processer. Yderligere, kan parametrene af ordningen for eksperimentel styres lettere for studier i tylakoid membran. Liposomer var allerede vist sig at være et udmærket redskab til at studere fotosyntetiske komplekser. En stor fokus i fortiden var på anlægget LHC hvor effekten af ændret lipid sammensætning blev testet på LHC II20. I andre tilgange, protein-protein interaktion mellem forskellige LHC II var undersøgte21. Også, nogle undersøgelser i grønalger blev udført at beskriver spontan klyngedannelse mellem LHC22. I betragtning af betydningen af kiselalger for vandøkosystemer, forholdsvis få undersøgelser blev udført med antenne komplekser af kiselalger. To studier undersøgt antenne komplekser af den centreret Cyclotella meneghiniana, hvor klynger af FCP antenne23 og lydhørhed af FCP til elektrokemiske gradienter24 blev vist. Liposomer er således et fremragende værktøj til at studere diatom antenner og deres interaktion og forordning i næsten oprindelige betingelser. Liposomer er alsidige siden mange betingelser som lipid sammensætning, Liposom størrelse, protein tæthed og den omkringliggende vandige fase kan kontrolleres. Metoden kræver desuden lavt beløb af prøver. Den eksperimentelle system er robust og meget reproducerbare. Opdelingen i Liposomer giver mulighed for at studere pH og ion forløb, som er vigtige faktorer i reguleringen af antenne komplekser.
Her beskriver vi isolering af FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres inkorporering i Liposomer med naturlige tylakoid lipid sammensætning. Også, vi leverer eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering af solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i Liposomer. Metoden opsummerer viden og standardiserede protokoller fremstillet af forbedringer af Gundermann og Büchel 201223, Natali et al. 201622og Ahmad og Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsprocessen. (1) henviser til punkt 1, som beskriver cellevækst, forstyrrelser og tylakoid isolation med følgende FCP adskillelse på saccharose tæthed gradienter; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) udarbejdelse af naturlige tylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) er beskrevet i stk. 2 og oprettelsen af lipid-vaskemiddel micelles med octylglycoside (OG). En defineret lipid-micelle størrelse opnås ved ekstrudering ved hjælp af membraner af defineret porestørrelse. FCP og lipid-micelles er samlet på en foruddefineret lipid: forhold mellem protein og vaske-og rengøringsmidler OG og β-Bettinas er fjernet via kontrollerede dialyse danner FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Planter, alger og kiselalger fotosyntetiske ydeevne afhænger stærkt af hurtig og effektiv regulering af de lette høst og energi overførsel processer i tylakoid membran af grønkorn. Lyset høst antenne af kiselalger, de såkaldte fucoxanthin klorofyl a/c-bindende proteiner (FCP), er nødvendige for let absorption og effektiv overførsel til den fotosyntetiske reaktion Centre såvel som for foto-beskyttelse mod overdreven lys. Skifte mellem disse to funktioner er en mangeårig spørgsmål om forskning. Mange af disse undersøgelser har været udført med FCP i vaske-og rengøringsmidler micelles. For interaktion undersøgelser, er vaske-og rengøringsmidler blevet fjernet, hvilket førte til en uspecifik sammenlægning af FCP komplekser. I denne tilgang er det svært at skelne mellem kulturgenstande og fysiologisk relevante data. Dermed kan mere værdifulde oplysninger om FCP og andre membran bundet lys høst komplekser fås ved at undersøge protein-protein interaktioner, energioverførsel og andre spektroskopiske egenskaber, hvis de er indlejret i deres native lipid miljø. Den største fordel er, at Liposomer har en defineret størrelse, og definerede lipid/protein forholdet som omfanget af FCP klynger styres. Yderligere, kan ændringer i pH og ion-sammensætning, der regulerer lys høst i vivo nemt simuleres. I forhold til tylakoid membran er Liposomer mere homogen og mindre komplekse, hvilket gør det lettere at opnå og forstå spektroskopiske data. Protokollen beskriver proceduren med FCP isolation og rensning, Liposom forberedelse og indarbejdelse af FCP i Liposomer med naturlige lipid sammensætning. Resultater fra en typisk anvendelse er givet og drøftet.

Protokollen beskriver isolering af samlede FCP fraktion fra Cyclotella meneghiniana og indarbejdelse i Liposomer med indfødte lipid sammensætning. Isolation tylakoid er yderst reproducerbare, men tylakoid udbytte kan ændre. Resultatet er acceptabelt, hvis mere end 50% af alle pigmenter er inddrevet i trin 1.1.4. Mere end 80% er optimal.
Oploesning af tylakoiderne er et kritisk skridt. Godt solubilized membraner opnå...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere fucoxanthin klorofyl a/c bindende proteiner (FCP) fra kiselalger og indarbejde dem i Liposomer med naturlige lipid kompositioner at studere excitation energioverførsel ved ion sammensætning ændringer.

Isolere og indarbejde lys-høst antenner fra Diatom Cyclotella Meneghiniana i Liposomer med tylakoid lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Forberedelse af Keratin hydrolysat fra kylling fjer og dens anvendelse i kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Enkel in-house ultra-højtydende kapillær kolonne fremstilling med FlashPack-tilgangen

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...