Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Wij danken Rana Adeel Ahmad voor bijstand in FCP zuivering. Prof. Claudia Büchel is erkend voor nuttige discussies en het lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door de Duitse Research Foundation naar LD (DI1956-1/1) en de Humboldt foundation voor een Feodor-Lynen fellowship aan LD.

Opmerking: Fotosynthetische complexen zoals FCPs zijn zeer gevoelig voor licht en warmte. Werkt altijd op ijs en onder een erg schemerig licht.
1. isolatie van FCP uit cellen
<ol><li>
Thylakoïde isolatie van C. meneghiniana cellen
	<ol>
<li>C. meneghiniana in vijf flessen van 500 mL die elk gevuld met 300 mL ASP-medium23,25 en 50 miljoen cellen groeien. Sluit de kolven met een stop...

FCP liposomen met natuurlijke lipide samenstelling verstrekt een handige, eenvoudige en reproduceerbare hulpmiddel om te onderzoeken van spectroscopische eigenschappen in vitro. Het lipide-milieu in FCP liposomen lijkt op de situatie binnen de thylakoïde membraan, die aanleiding geven tot experimentele resultaten die zich dichter bij het natuurlijke omstandigheden.
Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van C. meneghiniana als een modelsysteem voor FCP antenne. Het ...

Fotosynthetische organismen zoals diatomeeën moeten omgaan met veranderende lichtomstandigheden en reageren met verfijnde acclimatisering mechanismen die fotosynthetische hoogrenderende ondersteunen en beschermen tegen foto-oxidatieve schade veroorzaakt door het overmatige licht. Een grote licht-beschermende proces in fotosynthetische eukaryoten is de hoge energie blussen (qE) van geabsorbeerde licht dat zich als de belangrijkste bijdrage aan de niet-fotochemische blussen (NPQ) onder lichte stress voorwaarden1,2 voordoet ,3. De lichte oogsten antenne complexen (LHC) zijn betrokken bij de regulering van excitatie energie overdracht trajecten. In antwoord op hoge licht geïnduceerde lage pH in de chloroplast lumen, de antenne systeem schakelopties van het licht oogsten van status naar status het blussen. Deze dissipatief energietoestand beschermt photosystems (PS) en andere complexen in het membraan van thylakoïde foto-oxidatie. In fotosynthetische eukaryoten, wordt de qE meestal veroorzaakt door twee factoren1,-2,3. Een factor is het gespecialiseerde licht oogsten eiwit dat op de lage pH reageert. De publieke omroepen proteïne induceert de qE in hogere planten4. LhcSRs5, gemoduleerd door publieke omroepen activiteit, veroorzaken de qE in groene algen6. Diatomeeën bezitten Lhcx-achtige eiwitten die structuur verwant zijn aan de LHCSRs7,,8,,9,10.
De tweede factor van qE is de Xantofyl-cyclus waar carotenoïden van de antenne door de-epoxidatie omgezet in de vorm van een foto-beschermende en teruggekeerd door epoxidatie. In planten en groene algen, wordt Violaxanthine geconverteerd naar zeaxanthine. In diatomeeën, wordt diadinoxanthin geconverteerd naar diatoxanthin, die vervolgens met de omvang van NPQ11 correleert. Het licht van de Diatomee oogsten antenne bezit enkele eigenaardigheden, hoewel het evolutionaire gerelateerde te planten en algen LHCs. De overgang van licht aan foto-bescherming is enorm snel en de capaciteit van NPQ is hoger in vergelijking met planten12. Dit zou een reden waarom diatomeeën zijn ijzersterk in verschillende ecologische niches op een manier die zij verantwoordelijk voor 45% van de oceanische netto primaire productie13 zijn. Diatomee lichte oogsten systemen zijn dus een interessant object voor fotosynthese onderzoek.
Diatomeeën, zoals de centric soorten Cyclotella meneghiniana, intrinsieke licht thylakoïde oogsten systemen vernoemd naar de pigmenten die ze bezitten bind - fucoxanthin, chlorofyl (chl) a en c, vandaar FCP. Light oogsten van eiwitten, zoals FCPs, zijn ingebed in de thylakoïde membraan systeem dat bestaat uit verschillende lagen van het membraan. Diatomeeën vormen bands van drie thylakoiden. Dit complex situatie maakt het moeilijk om ze te bestuderen op moleculair niveau in het membraan van thylakoïde. Bovendien, vele componenten dragen bij aan de verordening van licht oogsten (zie hierboven). Daarom waren de complexen in vele benaderingen, geïsoleerd van het membraan met behulp van milde wasmiddelen, bijvoorbeeld n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), die solubilize van het membraan, maar de FCP-complexen intact te houden. Vele spectroscopische studies werden uitgevoerd met behulp van ontbindend FCP te onderzoeken intramoleculaire energie overdracht14,15,16,17. Deze voormalige aanpak was echter beperkt omdat de regulering van energie-overdracht excitonic interactie met andere antenne complexen of photosystems moet. Vandaar worden dit soort studies niet uitgevoerd met ontbindend complexen omdat de interactie tussen complexen verloren is.
Een belangrijk kenmerk in antenne verordening is de "moleculaire verdringing" van de antenne en photosystems in de thylakoïde membraan18. Voorheen, een eenvoudige benadering werd uitgevoerd om te simuleren van dit effect in vitro. Het wasmiddel werd verwijderd, wat leidt tot willekeurige aggregatie van antenne complexen. Hoewel sommige redelijke gegevens werd verkregen door deze aanpak17,19, de wasmiddel verwijdering weerspiegelt niet de situatie in vivo en kent een aantal beperkingen omdat het complexen zijn niet in hun reguliere tertiaire interactie structuur.
Het gebruik van liposomen overwint verscheidene van de vroegere beperkingen. De tertiaire structuur is nog volledig intact. Het liposoom membraan biedt een quasi-eigen omgeving voor de antenne-complexen. Het membraan scheidt de binnenkant van de liposomen van de buitenomgeving. Langs deze weg bieden liposomen twee reactie compartimenten voor studies van ion en pH verlopen ook wat transportprocessen. Verder kunnen de parameters van het experimentele systeem gemakkelijker worden beheerd voor studies in het membraan van thylakoïde. Liposomen bleken al te zijn een uitstekend hulpmiddel om te studeren fotosynthetische complexen. Een belangrijk aandachtspunt in het verleden was op de plant waar het effect van de gewijzigde lipide samenstelling is getest op LHC II20LHC. In andere benaderingen waren de eiwit-eiwit interactie tussen verschillende LHC II onderzochte21. Ook werden sommige studies in groene algen uitgevoerd die beschrijven spontane clustering tussen LHC22. Gezien het belang van diatomeeën voor aquatische ecosystemen, relatief weinig studies werden uitgevoerd met antenne complexen van diatomeeën. Twee studies onderzocht de complexen van de antenne van de centric Cyclotella meneghiniana, waar de clustering van de FCP antenne23 en reactievermogen van FCP elektrochemische verlopen24 werden getoond. Dus, liposomen zijn een uitstekend hulpmiddel om te studeren Diatomee antennes en hun interactie en de verordening in bijna oorspronkelijke omstandigheden. De liposomen zijn veelzijdig sinds vele aandoeningen zoals lipide samenstelling, grootte van de liposomen, eiwit dichtheid en de omliggende waterfase kan worden gecontroleerd. De methode vereist bovendien lage bedragen van monsters. Het experimentele systeem is robuust en zeer reproduceerbaar. De opdeling van liposomen zorgt voor het bestuderen van pH en ion hellingen, die zijn belangrijke factoren in de regulering van de antenne complexen.
Hier beschrijven we de isolatie van FCP antenne complexen van C. meneghiniana en hun opneming in liposomen met natuurlijke thylakoïde lipide samenstelling. Ook wij voorbeeldige gegevens leveren voor de spectroscopische karakterisering van ontbindend FCP en vergelijk deze met FCP in liposomen. De methode geeft een overzicht van kennis en gestandaardiseerde protocollen verkregen van de verbeteringen van de Gundermann en Büchel 201223, Natali et al. 201622en Ahmad en Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom. (1) verwijst naar alinea 1 die beschrijft celgroei, verstoring en thylakoïde isolatie met FCP scheiding aanleiding sacharose dichtheid verlopen; C. m. -Cyclotella meneghiniana cellen. (2) voorbereiding van natuurlijke thylakoïde lipide mengsel (MGDG, DGDG en SQDG) als beschreven in lid 2 en oprichting van lipide-wasmiddel micellen met octylglycoside (OG). Een gedefinieerde lipide-micel grootte wordt bereikt door met behulp van membranen met een diameter van gedefinieerde porie extrusie. FCP en lipide-micellen zijn herenigd op een vooraf gedefinieerde lipide: eiwitverhouding en de detergentia OG en β-DDM zijn verwijderd via gecontroleerde dialyse FCP proteoliposomes vormen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

De fotosynthetische prestaties van planten, algen en diatomeeën afhankelijk sterk van de snelle en efficiënte regulering van de lichte oogsten en energie overdracht processen in het membraan van de thylakoïde van chloroplasten. Het licht oogsten antenne van diatomeeën, de zogenaamde fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP), zijn vereist voor de absorptie van licht en efficiënte overdracht naar de fotosynthetische reactie centra alsmede voor foto-bescherming tegen buitensporige licht. Het schakelen tussen deze twee functies is een langdurige kwestie van onderzoek. Veel van deze studies zijn uitgevoerd met FCP in wasmiddel micellen. Voor studies van de interactie, zijn de detergentia verwijderd, die leidde tot een aspecifieke samenvoeging van FCP complexen. In deze aanpak is het moeilijk te discrimineren tussen artefacten en fysiologisch relevante gegevens. Vandaar, meer waardevolle informatie over FCP en andere membraan gebonden licht complexen oogst kan worden verkregen door het bestuderen van eiwit-eiwitinteractie, energie-overdracht en andere spectroscopische functies als ze zijn ingesloten in de omgeving van hun oorspronkelijke lipide. Het belangrijkste voordeel is dat liposomen hebben een gedefinieerde grootte en een gedefinieerde lipide/eiwitverhouding waarmee de mate van FCP clustering wordt gecontroleerd. Verder, veranderingen in de pH en ion samenstelling die regelen van licht oogsten in vivo kunnen gemakkelijk worden gesimuleerd. In vergelijking met het membraan van thylakoïde zijn de liposomen homogener en minder complex is, waardoor gemakkelijker te verkrijgen en te begrijpen van spectroscopische gegevens. Het protocol wordt de procedure beschreven van FCP isolatie en zuivering, liposomen voorbereiding en opneming van FCP in liposomen met natuurlijke lipide samenstelling. Het gevolg is van een typische toepassing zijn gegeven en besproken.

Het protocol wordt beschreven voor de isolatie van de totale FCP-Fractie van Cyclotella meneghiniana en opneming in liposomen met inheemse lipide samenstelling. Het isolement thylakoïde is zeer reproduceerbaar, maar de opbrengst thylakoïde kan veranderen. Het resultaat is aanvaardbaar als meer dan 50% van alle pigmenten worden teruggevorderd in stap 1.1.4. Meer dan 80% is optimaal.
De solubilisatie van de thylakoiden ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Hier presenteren we een protocol om te isoleren fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP) van diatomeeën en in liposomen met natuurlijke lipide composities aan het bestuderen van excitatie energieoverdracht op ion samenstelling veranderingen te integreren.

Isoleren en de integratie van licht-oogst antennes van Diatomee Cyclotella Meneghiniana in liposomen met thylakoïde lipiden

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Voorbereiding van keratine hydrolysaat van kippenveren en haar toepassing in cosmetica

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...