Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
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Wir danken für die Unterstützung bei FCP Reinigung Rana Adeel Ahmad. Prof. Claudia Büchel ist für hilfreiche Diskussionen anerkannt und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, LD (DI1956-1/1) und der Humboldt-Stiftung für ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium für LD unterstützt.

Hinweis: Photosynthetischen komplexe wie FCPs sind sehr anfällig für Licht und Wärme. Arbeiten Sie immer auf dem Eis und unter einem sehr schwachem Licht.
1. Isolierung der FCP aus Zellen
<ol><li>
Thylakoidmembran Isolation von C. Meneghiniana Zellen
	<ol>
<li>Wachsen Sie C. Meneghiniana in fünf 500 mL-Flaschen, die jeweils mit 300 mL von ASP-Medium23,25 und 50 Millionen Zellen ...

FCP Liposomen mit natürlichen lipidzusammensetzung bieten eine praktische, einfache und reproduzierbare Werkzeug, um spektroskopische Eigenschaften zu untersuchen in-vitro-. Die Lipid-Umwelt in FCP Liposomen ähnelt die Situation innerhalb der Thylakoidmembran Membran, was zu experimentellen Ergebnissen, die näher an der natürlichen Bedingungen sind.
Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von C. Meneghiniana als Modellsystem für FCP-Antenne. Es wächst relativ schnel...

Photosynthetische Organismen wie Kieselalgen müssen mit wechselnden Lichtverhältnissen bewältigen und mit anspruchsvollen Akklimatisierung Mechanismen, die nachhaltig hohe photosynthetischen Leistungsfähigkeit und schützt vor Foto-oxidative Schäden, die durch das übermäßige Licht reagieren. Ein bedeutenden Licht-Schutz-Prozess in den photosynthetischen Eukaryotes ist die hochenergetische abschrecken (QE) absorbiert Licht, das auftritt, als der wichtigste Beitrag zur nicht-photochemische abschrecken (NPQ) unter Lichtstress Bedingungen1,2 ,3. Die leichte Ernte Antennenkomplexe (LHC) sind bei der Regulierung der Übertragung Energiebahnen Erregung beteiligt. Als Reaktion auf hohe Licht induzierten niedriger pH-Wert in den Chloroplasten Lumen, die Antenne System Schalter aus dem Licht, die Ernte in den abschrecken Zustand. Dieses dissipativen Energiezustand verhindert photosysteme (PS) und anderen Anlagen in der Thylakoidmembran Membran Photooxidation. In den photosynthetischen Eukaryotes wird QE in der Regel durch zwei Faktoren1,2,3induziert. Ein Faktor ist das spezielle Licht Ernte Protein, das auf den niedrigen pH-Wertreagiert. Die PsbS-Protein induziert die QE in höheren Pflanzen4. LhcSRs5, moduliert durch PsbS Aktivität induzieren die QE in Grünalgen6. Kieselalgen besitzen Lhcx-ähnliche Proteine, die strukturell verwandt mit LHCSRs7,8,9,10.
Der zweite Faktor qE ist das Xanthophyll Zyklus wo Carotinoide der Antenne in Form eines Foto-Schutz durch de-Epoxidierung umgewandelt und durch Epoxidierung zurückgesetzt. In Pflanzen und Grünalgen wird Violaxanthin in Zeaxanthin konvertiert. In Diatomeen ist Diatoxanthin, Diadinoxanthin konvertiert, die dann mit dem Ausmaß der NPQ11 korreliert. Die Diatomee Licht Ernte Antenne besitzt einige Besonderheiten, obwohl es evolutionär im Zusammenhang mit Pflanzen und Algen LHCs ist. Der Wechsel von Licht, die Ernte bis zur Foto-Schutz ist enorm schnell und die NPQ Kapazität ist höher im Vergleich zu Pflanzen12. Dies könnte ein Grund sein, warum Diatomeen sind sehr erfolgreich in verschiedenen ökologischen Nischen in einer Weise, die sie für bis zu 45 % der ozeanischen Primärproduktion13verantwortlich sind. Diatomee leichte Ernte Systeme sind daher ein interessantes Objekt der Fotosynthese Forschung.
Diatomeen, wie die centric Art Cyclotella Meneghiniana Thylakoidmembran inneren Licht Ernte Systeme benannt nach die Pigmente, die sie besitzen binden - Fucoxanthin, Chlorophyll (Chl) a und C, also FCP Licht Ernte Proteine, wie z. B. FCPs, sind eingebettet in die Thylakoidmembran-Membran-System, bestehend aus mehreren Schichten der Membran. Kieselalgen bilden Bands der drei Thylakoids. Dieser Komplex Situation macht es schwierig, sie zu studieren, auf molekularer Ebene in die Thylakoidmembran Membran. Darüber hinaus tragen viele Komponenten bei der Regulierung von Licht, die Ernte (siehe oben). Daher wurden in vielen Ansätzen, die komplexe isoliert aus der Membran mit Feinwaschmittel, wie n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (β-DDM), die anderweitig der Membran aber die FCP-komplexe intakt zu halten. Viele spektroskopische Untersuchungen wurden durchgeführt mit solubilisiert FCP, um Intramolekulare Energie Übertragung14,15,16,17zu untersuchen. Jedoch war dieser ehemaligen Ansatz beschränkt, da die Regulierung der Energieübertragung excitonic Interaktion mit anderen Antennenkomplexe oder photosysteme braucht. Daher können nicht diese Art von Studien mit solubilisiert komplexe erfolgen, weil die Interaktion zwischen komplexen verloren geht.
Ein wichtiges Merkmal im Antenne-Verordnung ist die "Molekulare Verdrängung" der Antenne und phototrophen in die Thylakoidmembran Membran18. Früher ein einfacher Ansatz wurde durchgeführt, um diesen Effekt zu simulieren in-vitro-. Das Waschmittel wurde entfernt, was zu zufälligen Aggregation der Antennenkomplexe führt. Obwohl einige vernünftigen Daten von diesem Ansatz17,19erworben wurde, das Reinigungsmittel entfernen spiegelt nicht die Situation in Vivo und hat einige Einschränkungen, da die komplexe nicht in ihre regelmäßigen Tertiär interagieren Struktur.
Die Verwendung von Liposomen überwindet einige der ehemaligen Einschränkungen. Die Tertiärstruktur ist noch völlig intakt. Der liposomenmembran bietet eine quasi-native Umgebung für die Antennenkomplexe. Die Membran trennt das Innere der Liposomen aus der äußeren Umgebung. Auf diese Weise bieten Liposomen zwei Reaktion Fächer für Studien von Ionen und pH Gradienten sowie Transportprozesse. Darüber hinaus können die Parameter des experimentellen Systems leichter für Studien in der Thylakoidmembran Membran gesteuert werden. Liposomen bereits erwiesen sich ein ausgezeichnetes Werkzeug, photosynthetischen komplexe zu studieren. Ein wichtiger Schwerpunkt in der Vergangenheit wurde auf Pflanze LHC, wo die Wirkung der veränderte lipidzusammensetzung am LHC II20getestet wurde. In anderen Ansätzen Proteinprotein Interaktionen zwischen verschiedenen LHC II waren untersuchten21. Darüber hinaus wurden einige Studien in Grünalgen durchgeführt, die beschreiben, spontane clustering zwischen LHC22. In Anbetracht der Bedeutung von Kieselalgen für aquatische Ökosysteme wurden relativ wenige Studien mit Antennenkomplexe von Kieselalgen durchgeführt. Zwei Studien untersuchten die Antennenkomplexe centric Cyclotella Meneghiniana, wo das clustering der FCP Antenne23 und Reaktionsfähigkeit des FCP auf elektrochemischen Gradienten24 wurden gezeigt. Liposomen sind somit ein hervorragendes Instrument Diatomee Antennen und deren Interaktion und Regulierung in fast native Bedingungen zu studieren. Die Liposomen sind vielseitig, da viele Bedingungen wie lipidzusammensetzung, Liposomen Größe, Protein-Dichte und die umgebende wässrige Phase angesteuert werden. Die Methode erfordert darüber hinaus geringe Mengen an Proben. Die experimentelle System ist robust und hoch reproduzierbare. Die Abschottung der Liposomen ermöglicht Studium pH und Ionen-Gradienten, die wichtig sind bei der Regulierung der Antennenkomplexe Faktoren.
Hier beschreiben wir die Isolation der FCP Antennenkomplexe von C. Meneghiniana und ihre Eingliederung in den Liposomen mit natürlichen Thylakoidmembran lipidzusammensetzung. Auch wir bieten beispielhafte Daten für die spektroskopische Charakterisierung von solubilisiert FCP und vergleichen Sie sie mit FCP in Liposomen. Die Methode fasst wissen und standardisierte Protokolle von den Verbesserungen der Gundermann und Büchel 201223, Natali Et Al. 201622und Ahmad und Dietzel 201724erhalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows. (1) bezieht sich auf Absatz 1 beschreibt Zellwachstum, Störung und Thylakoidmembran Isolation mit FCP Trennung im Anschluss an Saccharose Dichtegradienten; C. m. -Cyclotella Meneghiniana Zellen. (2) Vorbereitung der natürlichen Thylakoidmembran Lipid Mischung (MGDG, DGDG und SQDG) gemäß Absatz 2 und die Schaffung von Lipid-Reinigungsmittel Micellen mit Octylglycoside (OG). Eine definierte Lipid-Micelle Größe wird durch Extrusion mit Membranen von einer definierten Porendurchmesser erreicht. FCP und Lipid-Mizellen sind vereint in einem vordefinierten Lipid: Protein-Verhältnis und die Reinigungsmittel OG und β-DDM sind entfernte über kontrollierte Dialyse FCP Proteoliposomes bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Die photosynthetische Leistungsfähigkeit von Pflanzen, Algen und Diatomeen hängt stark von der schnelle und effiziente Regulierung der leichte Ernte und Energie Transferprozesse in der Thylakoidmembran Membran der Chloroplasten. Das Licht, die Ernte Antenne von Kieselalgen, die so genannte Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP), sind erforderlich für die Lichtabsorption und effiziente Übertragung der photosynthetischen Reaktion Zentren sowie für Foto-Schutz vor übermäßig viel Licht. Der Wechsel zwischen diesen beiden Funktionen ist eine langjährige Frage der Forschung. Viele dieser Studien wurden mit FCP in Waschmittel Micellen durchgeführt. Für Studien zu Wechselwirkungen wurden die Reinigungsmittel entfernt, was dazu führte, eine unspezifische Aggregation der FCP-komplexe. Bei diesem Ansatz ist es schwer, zwischen Artefakten und physiologisch relevanten Daten zu unterscheiden. Daher erhalten wertvoller Informationen zu FCP und andere Membran gebunden leichte Ernte komplexe von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Energieübertragung und andere spektroskopischen Eigenschaften zu studieren, wenn sie in ihrer Muttersprache Lipid-Umgebung eingebettet sind. Der Hauptvorteil ist, dass Liposomen haben eine definierte Größe und einem definierten Lipid/Protein-Verhältnis durch die das Ausmaß der FCP-clustering gesteuert wird. Darüber hinaus können Veränderungen in der pH und Ionen-Zusammensetzung, das Licht, die Ernte in Vivo regulieren einfach simuliert werden. Im Vergleich zu der Thylakoidmembran Membran sind die Liposomen homogener und weniger komplex, wodurch es einfacher, spektroskopischen Daten zu erhalten. Das Protokoll beschreibt den Ablauf der FCP-Isolierung und Reinigung, Liposomen Vorbereitung und Einbindung der FCP in Liposomen mit natürlichen lipidzusammensetzung. Ergibt sich aus einer typischen Anwendung sind gegeben und diskutiert.

Das Protokoll beschreibt die Isolierung des gesamten FCP-Fraktion aus Cyclotella Meneghiniana und Einbindung in Liposomen mit native lipidzusammensetzung. Die Thylakoidmembran Isolation ist hoch reproduzierbare, aber die Thylakoidmembran Ausbeute kann sich ändern. Das Ergebnis ist akzeptabel, wenn mehr als 50 % aller Pigmente im Schritt 1.1.4 wiederhergestellt werden. Mehr als 80 % ist optimal.
Die Solubilisierung der ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

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Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

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Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

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