Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

FCP शुद्धिकरण में सहायता के लिए हम राणा Adeel अहमद का धन्यवाद करते हैं । प्रो क्लाउडिया Büchel उपयोगी विचार विमर्श के लिए स्वीकार किया है और पांडुलिपि पढ़ने । इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन द्वारा एलडी (DI1956-1/1) और एलडी को फ़ेयोडोर-Lynen फेलोशिप के लिए पीरु फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया ।

नोट: संश्लेषक परिसरों जैसे FCPs अत्यधिक प्रकाश और गर्मी की चपेट में हैं । हमेशा बर्फ पर और एक बहुत ही मंद प्रकाश के तहत काम करते हैं ।
1. कोशिकाओं से FCP का अलगाव
<ol><li>
C. meneghiniana कोशिकाओं से Thylak...

FCP liposomes प्राकृतिक लिपिड संरचना के साथ एक आसान, सरल और reproducible के लिए इन विट्रो में स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों की जांच उपकरण प्रदान करते हैं । FCP liposomes में लिपिड वातावरण thylakoid झिल्ली के भीतर की स्थिति जैसा दिखता है...

ऐसे diatoms के रूप में संश्लेषक जीवों कभी बदलने प्रकाश शर्तों के साथ सामना करना चाहिए और परिष्कृत acclimation तंत्र है कि उच्च संश्लेषक क्षमता को बनाए रखने और फोटो ऑक्सीडेटिव अत्यधिक प्रकाश की वजह से नुकसान से बचाने के साथ प्रतिक्रिया । संश्लेषक eukaryotes में एक प्रमुख प्रकाश सुरक्षात्मक प्रक्रिया उच्च ऊर्जा शमन (क्यूई) अवशोषित प्रकाश कि गैर करने के लिए मुख्य योगदान के रूप में होता है photochemical शमन (NPQ) प्रकाश तनाव की स्थिति के तहत1,2 ,3. लाइट हार्वेस्टिंग एंटीना परिसरों (LHC) उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण रास्ते के विनियमन में शामिल हैं । chloroplast लुमेन में उच्च प्रकाश प्रेरित कम पीएच के जवाब में, एंटीना प्रणाली प्रकाश संचयन राज्य से शमन राज्य के लिए स्विच करता है. इस ऊर्जा अपव्यय राज्य photosystems (पुनश्च) और फोटो-ऑक्सीकरण से thylakoid झिल्ली में अन्य परिसरों की रक्षा करता है । संश्लेषक eukaryotes में, qE आमतौर पर दो कारकों1,2,3द्वारा प्रेरित है । एक कारक विशेष प्रकाश संचयन प्रोटीन है कि कम पीएचको जवाब है । PsbS प्रोटीन उच्च संयंत्रों में क्यूई लाती4। LhcSRs5, PsbS गतिविधि द्वारा संग्राहक, हरी शैवाल6में क्यूई प्रेरित । Diatoms Lhcx-प्रोटीन की तरह है जो संरचनात्मक LHCSRs7,8,9,10से संबंधित अधिकारी ।
qE का दूसरा कारक xanthophyll चक्र है जहां एंटीना के carotenoids को डी-epoxidation द्वारा फोटो-सुरक्षात्मक रूप में परिवर्तित किया जाता है और epoxidation द्वारा वापस किया जाता है । पौधों और हरित शैवाल में violaxanthin को zeaxanthin में परिवर्तित किया जाता है । diatoms में, diadinoxanthin diatoxanthin में कनवर्ट किया जाता है, जो NPQ11की सीमा के साथ फिर से संबद्ध है । यह संयंत्र और मनोरथ LHCs से संबंधित विकासवादी है, हालांकि diatom प्रकाश संचयन एंटीना कुछ ख़ासियत के पास । फोटो संरक्षण के लिए प्रकाश संचयन से स्विच अत्यधिक तेजी से है और NPQ क्षमता पौधों की तुलना में अधिक है12। यह एक कारण है कि diatoms अलग पारिस्थितिकी niches में एक तरीका है कि वे ओशियानिक शुद्ध प्राथमिक उत्पादन13के ४५% तक के लिए जिंमेदार है में बहुत सफल रहे है हो सकता है । इसलिए, diatom लाइट हार्वेस्टिंग सिस्टम प्रकाश संश्लेषण की एक दिलचस्प वस्तु अनुसंधान कर रहे हैं ।
Diatoms, केंद्रित प्रजातियों Cyclotella meneghiniana की तरह, thylakoid आंतरिक प्रकाश संचयन प्रणालियों के नाम pigments वे बांध के बाद-fucoxanthin, क्लोरोफिल (chl) ए और सी, इसलिए FCP । लाइट हार्वेस्टिंग प्रोटीन, जैसे FCPs, कई झिल्ली परतों शामिल thylakoid झिल्ली प्रणाली में एंबेडेड । तीन thylakoids के Diatoms फार्म बैंड । इस जटिल स्थिति से उन्हें thylakoid झिल्ली में आणविक स्तर पर अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है. इसके अलावा, कई घटक प्रकाश संचयन के विनियमन में योगदान (ऊपर देखें) । इसलिए, कई तरीकों में, परिसरों में हल्के डिटर्जेंट का उपयोग कर झिल्ली से अलग-थलग थे, जैसे n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-डीडीएम), जो झिल्ली solubilize लेकिन FCP परिसरों बरकरार रखें । intramolecular ऊर्जा अंतरण14,15,16,17की जांच के लिए solubilized FCP का प्रयोग करते हुए कई स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययनों का प्रदर्शन किया गया । हालांकि, यह पूर्व दृष्टिकोण ऊर्जा हस्तांतरण के विनियमन के बाद से सीमित था अंय एंटीना परिसरों या photosystems के साथ excitonic बातचीत की जरूरत है । इसलिए, अध्ययनों के इन प्रकार के बाहर solubilized परिसरों के साथ नहीं किया जा सकता है क्योंकि परिसरों के बीच बातचीत खो दिया है ।
एंटीना विनियमन में एक महत्वपूर्ण विशेषता "thylakoid झिल्ली18में एंटीना और photosystems की आणविक भीड़" है । पूर्व में, एक साधारण दृष्टिकोण बाहर किया गया था इन विट्रो में इस आशय का अनुकरण । डिटर्जेंट हटा दिया गया था, जो एंटीना परिसरों के यादृच्छिक एकत्रीकरण की ओर जाता है । हालांकि कुछ उचित डेटा इस दृष्टिकोण17,19द्वारा प्राप्त किया गया था, डिटर्जेंट हटाने की स्थिति vivo में प्रतिबिंबित नहीं करता है और कुछ सीमाएं हैं क्योंकि परिसरों में उनके नियमित तृतीयक में बातचीत नहीं कर रहे हैं संरचना.
liposomes का उपयोग पूर्व सीमाओं के कई पर काबू । तृतीयक संरचना अभी भी पूरी तरह बरकरार है । liposome झिल्ली एंटीना परिसरों के लिए एक अर्ध-देशी वातावरण प्रदान करता है । झिल्ली बाहर के वातावरण से liposome के अंदर अलग होती है. इन साधनों के द्वारा, liposomes आयन और पीएच ढाल के रूप में अच्छी तरह से परिवहन प्रक्रियाओं के लिए अध्ययन के लिए दो प्रतिक्रिया डिब्बों प्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्रायोगिक प्रणाली के मापदंडों thylakoid झिल्ली में अध्ययन के लिए और अधिक आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है । Liposomes पहले से ही संश्लेषक परिसरों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण होने के लिए दिखाए गए थे । अतीत में एक प्रमुख ध्यान संयंत्र LHC पर था, जहां बदल लिपिड संरचना के प्रभाव LHC द्वितीय20पर परीक्षण किया गया था । अंय दृष्टिकोणों में, विभिंन LHC द्वितीय के बीच प्रोटीन प्रोटीन संपर्क21जांच की गई । इसके अलावा, हरी शैवाल में कुछ अध्ययनों से बाहर किया गया है कि LHC22के बीच सहज clustering का वर्णन । जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए diatoms के महत्व को ध्यान में रखते हुए, अपेक्षाकृत कुछ अध्ययनों diatoms के एंटीना परिसरों के साथ प्रदर्शन किया गया । दो अध्ययनों से केंद्रित Cyclotella meneghiniana के एंटीना परिसरों की जांच की, जहां clustering के FCP एंटीना23 और FCP की जवाबदेही विद्युत ढाल24 के लिए दिखाया गया । इस प्रकार, liposomes एक उत्कृष्ट उपकरण के लिए diatom एंटेना और उनके संपर्क और लगभग देशी परिस्थितियों में विनियमन अध्ययन कर रहे हैं । liposomes लिपिड संरचना, liposome आकार, प्रोटीन घनत्व और आसपास जलीय चरण के रूप में कई शर्तों के बाद से बहुमुखी है नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि नमूनों की कम मात्रा की आवश्यकता है । प्रायोगिक प्रणाली मजबूत और अत्यधिक reproducible है । liposomes के compartmentalization पीएच और आयन ढाल, जो एंटीना परिसरों के विनियमन में महत्वपूर्ण कारक है अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।
यहां, हम meneghiniana और प्राकृतिक thylakoid लिपिड संरचना के साथ liposomes में उनके शामिल होने से FCP एंटीना परिसरों के अलगाव का वर्णन । इसके अलावा, हम solubilized FCP के स्पेक्ट्रोस्कोपी लक्षण वर्णन के लिए अनुकरणीय डेटा प्रदान करते है और उंहें liposomes में FCP के साथ तुलना करें । विधि ज्ञान और मानकीकृत Gundermann और Büchel २०१२23, नाताली एट अल २०१६22, और अहमद और Dietzel २०१७24के सुधार से प्राप्त प्रोटोकॉल संक्षेप ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> चित्र 1: कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । (1) पैरा 1 को संदर्भित करता है जो सुक्रोज घनत्व ढाल पर निंनलिखित FCP जुदाई के साथ सेल विकास, व्यवधान और thylakoid अलगाव का वर्णन; सी. एम. -Cyclotella meneghiniana कोशिकाओं. (२) पैरा २ में वर्णित प्राकृतिक thylakoid लिपिड मिश्रण (MGDG, DGDG और SQDG) की तैयारी और लिपिड-डिटर्जेंट micelles के साथ octylglycoside (ओग) का निर्माण. एक परिभाषित लिपिड-micelle आकार बाहर निकालना द्वारा एक निर्धारित ताकना व्यास की झिल्ली का उपयोग करके हासिल की है । FCP और लिपिड-micelles एक पूर्वनिर्धारित लिपिड में एकीकृत कर रहे हैं: प्रोटीन अनुपात और डिटर्जेंट ओग और β-डीडीएम नियंत्रित डायलिसिस के गठन FCP proteoliposomes के माध्यम से हटा रहे हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

पौधों, शैवाल और diatoms के संश्लेषक प्रदर्शन दृढ़ता से chloroplasts की thylakoid झिल्ली में प्रकाश संचयन और ऊर्जा हस्तांतरण प्रक्रियाओं के तेज और कुशल विनियमन पर निर्भर करता है । diatoms के प्रकाश संचयन एंटीना, तथाकथित fucoxanthin क्लोरोफिल एक/सी बाध्यकारी प्रोटीन (FCP), प्रकाश अवशोषण और संश्लेषक प्रतिक्रिया केंद्रों के लिए कुशल हस्तांतरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोटो के लिए अत्यधिक प्रकाश से सुरक्षा के लिए आवश्यक हैं । इन दो कार्यों के बीच स्विच अनुसंधान के एक लंबे समय से खड़ा है । इनमें से कई अध्ययनों को डिटर्जेंट micelles में FCP के साथ किया गया है । संपर्क अध्ययन के लिए, डिटर्जेंट हटा दिया गया है, जो FCP परिसरों के एक विशिष्ट एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व किया । इस दृष्टिकोण में, यह कलाकृतियों और शारीरिक रूप से प्रासंगिक डेटा के बीच भेदभाव करने के लिए कठिन है । इसलिए, FCP और अन्य झिल्ली के बारे में अधिक मूल्यवान जानकारी प्रकाश संचयन परिसरों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, ऊर्जा अंतरण और अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधाओं का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है यदि वे अपने देशी लिपिड वातावरण में एम्बेडेड हैं. मुख्य लाभ यह है कि liposomes एक परिभाषित आकार और एक परिभाषित लिपिड/FCP clustering की हद तक नियंत्रित किया जाता है जिसके द्वारा । इसके अलावा, पीएच और आयन संरचना में परिवर्तन है कि vivo में प्रकाश संचयन को विनियमित आसानी से नकली जा सकता है । thylakoid झिल्ली की तुलना में, liposomes अधिक समरूप और कम जटिल हैं, जो इसे प्राप्त करने और स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा को समझने के लिए आसान बनाता है । प्रोटोकॉल FCP अलगाव और शुद्धि, liposome तैयारी की प्रक्रिया का वर्णन है, और प्राकृतिक लिपिड संरचना के साथ liposomes में FCP का निगमन । एक ठेठ आवेदन से परिणाम दिया और चर्चा कर रहे हैं ।

प्रोटोकॉल देशी लिपिड संरचना के साथ liposomes में Cyclotella meneghiniana और निगमन से कुल FCP अंश के अलगाव का वर्णन । thylakoid अलगाव अत्यधिक reproducible है, लेकिन thylakoid उपज बदल सकता है । परिणाम अगर सभी pigments के ५०% से अधिक कदम 1.1.4 म?...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

यहां, हम diatoms से fucoxanthin क्लोरोफिल एक/सी बाध्यकारी प्रोटीन (FCP) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और उंहें प्राकृतिक लिपिड रचनाओं के साथ liposomes में शामिल करने के लिए आयन संरचना परिवर्तन पर उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण का अध्ययन ।

अलग और Diatom Cyclotella Meneghiniana से Thylakoid लिपिड के साथ Liposomes में प्रकाश संचयन एंटेना शामिल

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

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