Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
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FCP の浄化支援ありがとうラナ Adeel アフマド。教授クラウディア Büchel は役に立つ議論のため認められている原稿を読む。この作品は LD (DI1956-1/1) にドイツ語研究財団および LD へフェオドル ・ リュネン フェローシップのフンボルト財団によって支えられました。

注:FCPs など光合成複合体が光と熱に対して非常に脆弱です。氷の上、非常に薄暗い光の下では常に動作します。
1. 細胞から FCP の分離
<ol><li>
C. meneghiniana細胞からチラコイド分離
	<ol>
<li>C. meneghiniana 5 500 mL フラスコ 300 mL ASP 中23,25と 5000 万セルの満ちているそれぞれに成長します。綿栓付?...

FCP リポソーム天然脂質組成と分光学的性質を調査するための便利なシンプルで再現性のあるツールを提供するの in vitro 。FCP リポソームの脂質環境は、自然の状態に近い実験結果を生じ、チラコイド膜内状況に似ています。
FCP アンテナのモデル システムとしてc. meneghinianaを使用していくつかの利点があります。それは比較的速い成長、他の珪藻のモデル種...

珪藻など光合成生物必要があります刻 々 変化する光条件に対処し、光合成効率を維持し、過剰な光によって写真酸化ダメージから保護する高度順化のメカニズムと対応します。光合成真核生物の主要な光保護プロセスは高エネルギー焼入れ (qE) の光ストレス条件1,2 の下で非光化学の焼入 (NPQ) への主要な貢献として発生する吸収光 ,3。光の収穫アンテナ複合体 (LHC) は、励起エネルギー移動経路の調節に関与しています。高い光に応答低pH葉緑体ルーメン、集光状態を急冷状態からアンテナ システム スイッチを誘発しました。このエネルギー散逸状態は、光酸化からのダメージを与える (PS) とチラコイド膜の他の複合体を保護します。光合成真核生物で qEは通常、2 つの要因1,2,3によって誘導します。要因の一つは、特殊な集光性タンパク質低pHに応答します。PsbS 蛋白質はより高い植物4qEを誘導します。LhcSRs5、PsbS 活動によって変調は、緑藻6で qEを誘発します。珪藻では、構造的に LHCSRs7,8,9,10に関連している Lhcx のような蛋白質を所有しています。
QEの 2 番目の要素は、アンテナのカロテノイドが de エポキシ化によって写真保護形式に変換、エポキシ化によって元に戻さキサントフィル サイクルです。植物や緑藻、ビオラキサンチンはゼアキサンチンに変換されます。珪藻の diadinoxanthin は NPQ11の程度と相関し、diatoxanthin に変換されます。珪藻集光アンテナはそれは進化植物と藻類の LHCs に関連するいくつかの特性を所有しています。光の写真の保護するために収穫からスイッチが非常に高速と NPQ 容量は植物12に比べて高い。これは珪藻が13海洋純一次生産量の 45% までに責任がある方法でさまざまな生態学的ニッチの非常に成功した 1 つの理由があります。したがって、光収穫系珪藻は光合成研究の興味深いオブジェクトです。
珪藻、峰 meneghinianaの中心の種は、チラコイド本質的な集光性色素にちなんで彼らのシステムを所有しているようなバインド - フコキサンチン、クロロフィル a と c、それゆえ FCP. 集光性タンパク質、FCPs などいくつかの膜層を構成するチラコイド膜システムに埋め込まれます。珪藻は、3 つのチラコイドのバンドを形作る。この複合体チラコイド膜で分子レベルで研究するが困難な状況です。さらに、多くのコンポーネントは、集光性 (上記参照) の規制に貢献します。したがって、さまざまな方法で複合体は、n-ドデシル-β-D-maltopyranoside (β-DDM)、膜可溶化が FCP 複合体をそのまま維持など、穏やかな洗剤を使用して膜から分離しました。可溶化された FCP を使用して分子内エネルギー転送14,15,16,17を調査する多くの分光学的研究を行った。しかし、この前者のアプローチは、エネルギー転送の規制が他のアンテナ複合体やダメージを与えると励起子相互作用を必要とするので、限られていた。したがって、これらの種類の研究が複合体間の相互作用が失われるためにを可溶化された錯体を実施できません。
アンテナ規制の重要な機能は、アンテナとチラコイド膜18のダメージを与える「分子クラウディング」です。以前は、単純なアプローチは、この効果をシミュレートするために実施された体外。アンテナ複合体のランダムな集約につながる洗剤が削除されました。いくつかの合理的なデータは、このアプローチの17,19によって得られた、洗剤除去体内の状況を反映していない、複合体は通常第三に対話していないのでいくつかの制限があります。構造体です。
リポソームを用いる元の制限のいくつかを克服します。第三構造は完全にそのままです。リポソーム膜はアンテナ複合体の準ネイティブ環境を提供します。膜は、リポソームの内部を外部環境から分離します。これらの手段では、リポソームは、輸送過程については同様のイオン ・ pH 勾配の研究の 2 つの反応区画を提供します。さらに、チラコイド膜の研究のため実験システムのパラメーターをより簡単に制御できます。リポソームは、既に光合成錯体を研究する優れたツールであること示されていた。過去の主要な焦点だった植物 LHC LHC II20に変更後の脂質組成の影響を調べた。他のアプローチで異なる LHC II 間の蛋白質蛋白質の相互作用は調査21だったまた、緑の藻でいくつかの研究を行った LHC22の間自発的なクラスタ リングについて説明します。、水生生物の生態系の珪藻の重要性を考慮した珪藻のアンテナ複合体に比較的少数の研究を行った。2 つの研究は、FCP アンテナ23と FCP の応答性の電気化学的勾配24にクラスタ リングが示した中心峰 meneghinianaのアンテナ複合体を検討しました。したがって、リポソーム、珪藻アンテナ相互作用とほぼネイティブ条件で規制を勉強する優れたツールです。リポソーム、脂質、リポソーム サイズ、密度などの多くの条件からの汎用性と周囲の水相を制御できます。さらに、メソッドのサンプルの少量が必要です。実験システムは、堅牢かつ再現性が高い。リポソームの区分により pH を勉強して、アンテナ複合体の調節に重要なイオン勾配要因。
ここでは、 c. meneghinianaから FCP アンテナ複合体の単離とその自然なチラコイド脂質リポソームについて述べる。また、可溶化された FCP の分光特性評価の模範的なデータを提供し、リポソームの FCP との比較します。メソッドは、知識と Gundermann と Büchel 2012 年23ナタリら2016年22アフマドと Dietzel 2017 年の24の改善から得られる標準化されたプロトコルをまとめたものです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> 図 1: ワークフローの模式図。( 1) 細胞の成長、混乱およびショ糖密度勾配; 次の FCP 分離チラコイド分離を説明する段落 1 を参照C. m.-峰 meneghiniana細胞。(2) 2 と octylglycoside (OG) 脂質界面活性剤ミセルの創造、自然チラコイド脂質混合物 (MGDG、DGDG SQDG) の調製は項で説明します。定義された脂質ミセルの大きさは、定義された孔径の膜を用いた押出によって実現されます。FCP と脂質ミセルが定義済みの脂質で統一: タンパク質比や OG と β DDM の洗剤は削除を介して制御される透析 FCP プロテオリポソームを形成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

強く、植物、藻類、珪藻類の光合成能力は、葉緑体のチラコイド膜での転送プロセスを光収穫とエネルギーの高速かつ効率的な規制に依存します。集光珪藻のアンテナと呼ばれるフコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP) が光の吸収に必要なと光合成反応に効率的に転送センター写真-過剰な光からの保護も同様。これら 2 つの関数の間のスイッチは、研究の長年問題です。これらの研究の多くは FCP で洗剤のミセルで行われています。相互作用の研究、FCP 錯体の非特異的凝集につながった、洗剤を削除されています。このアプローチで成果物と関連する生理学的データを区別するは難しいです。したがって、FCP や他の膜に埋もれた集光複合体についての有益な情報は、ネイティブ脂質環境に埋め込まれている場合、タンパク質間相互作用、エネルギー移動、他の分光学的特徴を研究することによって取得できます。主な利点は、リポソームが定義されているサイズと FCP のクラスタ リングの範囲を制御する定義された脂質・ タンパク質比ことです。さらに、集光性体内を調節する pH とイオン組成の変化は、簡単にシミュレートできます。チラコイド膜と比較してリポソームより均一なより少なく複雑な取得、分光学的データを理解して簡単に。プロトコルでは、FCP 分離精製、リポソーム調製と FCP の天然脂質リポソームへの取り込みの手順について説明します。一般的なアプリケーションからの結果が与えられ、議論。

プロトコルでは、峰 meneghiniana合計 FCP 画分の分離とネイティブ脂質リポソームに定款をについて説明します。チラコイドの分離は、再現性が高いが、チラコイド収量が変更します。結果が全ての顔料の 50% 以上が 1.1.4 のステップでリカバリする場合できます。80% 以上が最適です。
チラコイドの可溶化は、重要なス?...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

フコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP) 珪藻を分離し、天然の脂質組成のイオン組成変化の励起エネルギー移動を研究するリポソームにそれらを組み込むのためのプロトコルを紹介します。

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

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