Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Vi takker Rana Adeel Ahmad for hjelp i FCP rensing. Prof Claudia Büchel er anerkjent for nyttig diskusjoner og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation til LD (DI1956-1/1) og Humboldt grunnlaget for en Fjodor Lynen fellesskap til LD.

Merk: Fotosynteseaktiviteten komplekser som FCPs er svært sårbare for lys og varme. Alltid arbeide på is og en svært dårlig lys.
1. isolering av FCP fra celler
<ol><li>
Thylakoid isolasjon fra C. meneghiniana celler
	<ol>
<li>Vokse C. meneghiniana i fem 500 mL flasker har 300 mL av ASP-middels23,25 og 50 millioner celler. Koble flasker med en bomull stopper, og at cellene å vo...

FCP liposomer med naturlig lipid komposisjon gir en praktisk, enkel og reproduserbar verktøyet for å undersøke spektroskopiske egenskaper i vitro. Lipid miljøet FCP liposomer ligner situasjonen innen thylakoid membran, gir opphav til eksperimentelle resultater som er naturlige forhold.
Det er flere fordeler med å bruke C. meneghiniana som et modellsystem for FCP antenne. Det vokser relativt fort og mer robust i forhold til andre slektene modell arter, eksempelvis Tha...

Fotosynteseaktiviteten organismer som kiselalger må takle skiftende lysforhold og svare med sofistikert acclimation mekanismer som opprettholde høy fotosynteseaktiviteten effektivitet og beskytte mot Foto-oksidative skader forårsaket av overdreven lyset. En viktig lysbeskyttende prosess i fotosynteseaktiviteten eukaryoter kommer høy energi slukke (E) absorbert lys som forekommer som det viktigste bidraget til de ikke-fotokjemisk slukke (NPQ) under lette stress forhold1,2 ,3. Lette høsting antenne komplekser (LHC) er involvert i regulering av eksitasjon energi overføring trasé. Svar på høy lys indusert lav pH i chloroplast lumen, antenne system bryterne fra lyset høsting å slukke staten. Denne energien dissipative staten beskytter photosystems (PS) og andre komplekser i thylakoid membranen fra foto-oksidasjon. I fotosynteseaktiviteten eukaryoter, er qE vanligvis forårsaket av to faktorer1,2,3. En faktor som er spesialisert lyset høsting protein som svarer til den lave pH. PsbS protein induserer qE i høyere planter4. LhcSRs5, modulert av PsbS aktivitet, indusere qE i grønne alger6. Kiselalger har Lhcx-lignende proteiner som strukturelt relatert til LHCSRs7,8,9,10.
Den andre faktoren qE er den xanthophyll syklusen der karotenoider av antennen er konvertert til en foto-beskyttende de-epoxidation og erstattet av epoxidation. I planter og grønne alger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger konverteres diadinoxanthin til diatoxanthin, som deretter korrelerer med omfanget av NPQ11. Slektene lyset høsting antenne besitter noen selv om det er evolusjonære anlegget og alger LHCs. Overgangen fra lys høsting Foto-beskyttelse er enormt rask og NPQ kapasitet er høyere sammenlignet med planter12. Dette kan være en grunn til hvorfor Kiselalger er svært vellykket i ulike økologiske nisjer slik at de er ansvarlige for opptil 45% av oceanic netto primærproduksjon13. Derfor slektene lys høstingen systemer er en interessant gjenstand for fotosyntesen forskning.
Kiselalger, som sentriske arten Cyclotella meneghiniana, har thylakoid innebygd lys høstingen systemer oppkalt etter pigmentene de bind - fucoxanthin, klorofyll (chl) a og c, derav FCP. lys høsting proteiner, som FCPs, er innebygd i thylakoid membran som består av flere membran lag. Kiselalger danne band av tre thylakoids. Dette komplekset situasjonen gjør det vanskelig å studere dem på molekylært nivå i thylakoid membranen. I tillegg bidrar mange komponenter til regulering av lys høsting (se ovenfor). Derfor i mange tilnærminger ble komplekser isolert fra membranen bruke milde vaskemidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membran, men beholder FCP komplekser. Mange spektroskopiske studier ble utført med solubilized FCP for å undersøke intramolekylære energi overføring14,15,16,17. Denne tidligere var imidlertid begrenset siden regulering av energioverføring trenger excitonic interaksjon med andre antenne komplekser eller photosystems. Dermed slike studier kan ikke utføres med solubilized komplekser fordi samspillet mellom komplekser er tapt.
En viktig funksjon i antenne regulering er "molekylær trengsel" antenne og photosystems i thylakoid membran18. Tidligere, en enkel tilnærming ble utført for å simulere denne effekten i vitro. Vaskemiddel ble fjernet, noe som fører til tilfeldig samling av antenne komplekser. Selv om noen rimelig data ble innhentet av denne tilnærmingen17,19, vaskemiddel fjerning reflekterer ikke situasjonen i vivo og har noen begrensninger siden komplekser ikke er samhandlende på deres vanlige tertiær struktur.
Bruk av liposomer overvinner flere av de tidligere begrensningene. Tertiær strukturen er fortsatt fullt intakt. Liposome membranen tilbyr en kvasi innfødt miljø for antenne komplekser. Membranen skiller innsiden av liposome fra det ytre miljøet. Med disse midler gir liposomer to reaksjon rom for studier av ion og pH forløpningene for transport prosesser. Videre kan parameterne for eksperimentell systemet styres lettere for studier i thylakoid membranen. Liposomer var allerede vist seg å være et utmerket verktøy for å studere fotosynteseaktiviteten komplekser. Fokus i fortiden var på anlegget LHC hvor effekten av endrede lipid komposisjon ble testet på LHC II20. I andre tilnærminger, protein-protein samspillet mellom ulike LHC II ble undersøkt21. Også ble noen studier i grønne alger utført som beskriver spontan klynging mellom LHC22. Vurderer betydningen av kiselalger for akvatiske økosystemer, relativt få studier som ble utført med antenne komplekser av kiselalger. To studier undersøkt antenne komplekser av sentriske Cyclotella meneghiniana, der klynging FCP antenne23 og responsen til FCP til elektrokjemiske graderinger24 ble vist. Dermed er liposomer et utmerket verktøy for å studere slektene antenner og samhandling og regulering i nesten innfødt forhold. Liposomer er allsidig siden mange forhold som lipid komposisjon, liposome størrelse, protein tetthet og den omkringliggende vandige fasen kan kontrolleres. Videre krever metoden lave mengder prøver. Eksperimentell systemet er robust og svært reproduserbare. Compartmentalization av liposomer kan studere pH og ion graderinger, som er viktige faktorer i regulering av antenne komplekser.
Her beskriver vi isolering av FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres innlemmelse i liposomer med naturlig thylakoid lipid komposisjon. Også vi gi eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering av solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i liposomer. Metoden oppsummerer kunnskap og standardiserte protokoller fra forbedringer av Gundermann og Büchel 201223og Natali et al. 201622Ahmad og Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. (1) refererer til avsnitt 1 som beskriver cellevekst, avbrudd og thylakoid isolasjon med følgende FCP separasjon på sukrose tetthet forløpninger; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) utarbeidelse av naturlige thylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) beskrevet i avsnitt 2 og etableringen av lipid-rengjøringsmiddel micelles med octylglycoside (OG). En definert lipid-micelle størrelse oppnås ved ekstrudering bruker membraner med definerte pore diameter. FCP og lipid-micelles er samlet på en forhåndsdefinert lipid: protein forholdet og vaskemidler OG og β-DDM er fjernet via kontrollert dialyse danner FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Fotosynteseaktiviteten ytelsen til, alger og kiselalger avhenger sterkt på rask og effektiv regulering av lyset høsting og energi overføring prosesser i thylakoid membran av chloroplasts. Lyset høsting antenne av kiselalger, de såkalte fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteinene (FCP), kreves for lys absorpsjon og effektiv overføring til fotosynteseaktiviteten reaksjonen sentre også for bilde-mot overdreven lys. Bytt mellom disse to funksjonene er en langvarig forskning. Mange av disse studiene har utført med FCP i vaskemiddel micelles. For samhandling studier, er vaskemidler fjernet, og som førte til en uspesifikke samling av FCP komplekser. I denne metoden er det vanskelig å forskjellsbehandle gjenstander og fysiologisk relevante data. Derfor kan mer verdifull informasjon om FCP og andre membran bundet lette høsting komplekser fås ved å studere protein-protein interaksjoner, energioverføring og andre spektroskopiske funksjoner hvis de er innebygd i deres opprinnelige lipid miljø. Hovedfordelen er at liposomer har en definert størrelse og en definert lipid/protein som omfanget av FCP klynging er kontrollert. Videre kan enkelt endringer i pH og ion sammensetningen som regulerer lys høsting i vivo simuleres. I forhold til thylakoid membranen er liposomer mer homogen og mindre komplisert, som gjør det enklere å få og forstå spektroskopiske data. Protokollen beskriver fremgangsmåten FCP isolasjon og rensing, liposome forberedelse og inkorporering av FCP liposomer naturlig lipid sammensetning. Resultater fra en typisk applikasjon er gitt og diskutert.

Protokollen beskriver isolering av totale FCP brøkdel fra Cyclotella meneghiniana og innlemmelse i liposomer innfødt lipid sammensetning. Thylakoid isolasjon er svært reproduserbare, men thylakoid avkastningen kan endres. Resultatet er akseptabelt hvis mer enn 50% av alle pigmenter gjenopprettes i trinn 1.1.4. Mer enn 80% er optimal.
Solubilization av thylakoids er en avgjørende skritt. Godt solubilized membraner he...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Her presenterer vi en protokoll for å isolere fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteiner (FCP) fra kiselalger og innlemme dem i liposomer med naturlig lipid komposisjoner å studere eksitasjon energioverføring på ion justeringsendringer.

Isolere og innlemme lys-fangst antenner fra slektene Cyclotella Meneghiniana i liposomer med Thylakoid lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Enkel innebygd ultrahøy ytelse kapillær kolonneproduksjon med FlashPack-tilnærmingen

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...