Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Мы благодарим рана Adeel Ахмад за помощь в FCP очистки. Профессор Claudia Büchel признается за полезные обсуждения и читать рукопись. Эта работа была поддержана Немецкий исследовательский фонд, чтобы LD (DI1956-1/1) и Фонд Гумбольдта Феодор Линен стипендий на LD.

Примечание: Фотосинтетическая комплексы такие как FCPs весьма уязвимы для тепла и света. Всегда работайте на льду и очень тусклый свет.
1. изоляция FCP от клеток
<ol><li>
Тилакоидов изоляции от клеток C. meneghiniana
	<ol>
<li>Растут C. meneghiniana в пяти 500 мл колб, кот...

FCP липосомы с естественный липидный состав обеспечивают удобный, простой и воспроизводимые инструмент исследовать спектральные свойства в пробирке. Окружающей среды липидов в FCP липосомы напоминает ситуацию в тилакоидной мембраны, рождая экспериментальные результаты, которые н?...

Фотосинтетических организмов, таких как диатомовые водоросли должны справиться с постоянно меняющейся освещенности и реагировать с адаптационного сложные механизмы, которые поддерживать высокую эффективность фотосинтеза и защищать от фото окислительных повреждений, вызванных чрезмерным свет. Основной свет защитные процесс в фотосинтетические eukaryotes является высокой энергии закалочные (qE) поглощается света, который возникает как главный вклад не фотохимического тушения (ЕНОЛ) под легкий стресс условия1,2 ,3. Света уборки антенные комплексы (LHC) участвуют в регуляции пути передачи энергии возбуждения. В ответ на высокий свет индуцированной низкий рН в просвете хлоропластов, Антенные переключатели системы от света уборки тушения состояние. Этой энергии диссипативных государство защищает фотосистемы (PS) и других комплексов в тилакоидной мембране от фото окисления. В фотосинтетической эукариот qE индуцируется обычно двух факторов1,2,3. Одним из факторов является специализированным свет уборки белок, который реагирует с низким рН. ОВО белка индуцирует дЕ в высших растений4. LhcSRs5, модулированные деятельности ОВО, побудить дЕ в зеленых водорослей6. Диатомовые водоросли обладают Lhcx подобных белков, структурно связанные с LHCSRs7,8,9,10.
Второй фактор qE является цикл Ксантофилл где преобразован в форму фото защитные деэпоксидации и вернулась эпоксидирования каротиноиды антенны. В растениях и зеленые водоросли виолаксантина преобразуется в зеаксантин. В диатомовых водорослей diadinoxanthin преобразуется в diatoxanthin, который затем коррелирует с степень ЕНОЛ11. Диатомовые водоросли света уборки антенна обладает некоторые особенности, хотя это эволюционный, относящиеся к заводе и водорослей LHCs. Переход от света, заготовки для фото защиты чрезвычайно быстрый и ЕНОЛ способности выше по сравнению с растений12. Это может быть одной из причин, почему диатомеи очень успешно в различных экологических ниш в пути, что они отвечают за до 45% океанических чистой первичной продукции13. Таким образом диатомовые водоросли света уборки систем являются интересным объектом исследований фотосинтеза.
Диатомовые водоросли, как ориентированных видов Cyclotella meneghiniana, обладают тилакоидов внутренние свет заготовки систем, названный пигменты они связывают - фукоксантин, хлорофилла (ХЛ) a и c, поэтому FCP. света уборки белков, например FCPs, являются Встроенный в системе мембрана тилакоида состоит из нескольких слоев мембраны. Диатомовые водоросли образуют полосы три тилакоидов. Этот комплекс положение делает его трудным для их изучения на молекулярном уровне в тилакоидной мембраны. Кроме того многие компоненты способствуют регуляции света уборки (см. выше). Таким образом во многих подходов, комплексы были изолированы от мембраны, используя мягкий моющих средств, таких как н додецил β-D-maltopyranoside (β-DDM), который солюбилизировать последнего мембраны, но сохраняют FCP комплексов. Многие спектроскопические исследования были проведены с использованием растворимых FCP расследовать внутримолекулярной энергии передачи14,,1516,17. Однако этот бывший подход был ограничен, поскольку регулирование передачи энергии экситонных взаимодействие с другими антенные комплексы или фотосистемы. Следовательно, эти виды исследований не могут осуществляться с растворимых комплексов потому, что взаимодействие между комплексами теряется.
Важной особенностью в положении антенна является «молекулярная вытеснения» антенны и фотосистем в тилакоидной мембраны18. Ранее, простой подход было проведено, чтобы имитировать этот эффект в пробирке. Был удален моющих средств, что приводит к случайным агрегации антенных комплексов. Хотя некоторые разумные данных было получено17,этот подход19, моющего средства удаления не отражает ситуацию в естественных условиях и имеет некоторые ограничения, поскольку комплексы не взаимодействующих в их регулярных третичный структура.
Использование липосомы преодолевает несколько бывших ограничений. Третичная структура по-прежнему полностью нетронутыми. Липосомы мембраны обеспечивает квази родной среде для антенных комплексов. Мембрана отделяет внутри липосом из внешней среды. Этими средствами липосомы предоставляют две реакции отсеков для исследований Ион и pH градиентов, а также транспортных процессов. Кроме того параметры экспериментальной системы могут контролироваться более легко исследований в тилакоидной мембраны. Уже показано, что липосомы были отличным инструментом для изучения фотосинтетической комплексов. Основное внимание в прошлом был на заводе LHC, где влияние изменения липидного состава был протестирован на LHC II20. В других подходов протеин протеина взаимодействия между различными LHC II были исследованы21. Кроме того, некоторые в зеленых водорослей были проведены исследования описывают, спонтанное кластеризации между LHC22. Учитывая важность диатомовых водорослей для водных экосистем относительно немногие исследования проводились с антенные комплексы диатомовых водорослей. Два исследования исследованы антенные комплексы ориентированных Cyclotella meneghiniana, где были показаны кластеризации FCP антенна23 и оперативности FCP электрохимических градиентов24 . Таким образом липосомы являются отличным инструментом для изучения взаимодействия диатомовых антенн и их регулирования в условиях почти родной. Липосомы универсальны, поскольку многие условия, такие как липидного состава, липосомы размер, плотность белка и окружающей водной фазе может контролироваться. Кроме того этот метод требует низкого количества образцов. Экспериментальная система является надежной и высокую воспроизводимость. Изолированность липосомы позволяет для изучения рН и Ион градиенты, которые являются важными факторами в регулировании антенных комплексов.
Здесь мы описываем изоляции FCP антенных комплексов с C. meneghiniana и их включения в липосомах с естественным тилакоидов липидный состав. Кроме того мы предоставляем образцовые данные для спектральные характеристики растворимых FCP и сравнить их с FCP в липосомах. Метод обобщает знания и стандартизованных протоколов, полученные от улучшения Гундерманн и бушель 201223, Натали et al. 201622и24Ахмад и Дицеля 2017.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса. (1) относится к пункту 1, который описывает рост клеток, нарушения и изоляции тилакоид с following FCP разделения на градиенты плотности сахарозы; C. м. -Cyclotella meneghiniana клетки. (2) приготовления смеси натуральных тилакоидов липидов (MGDG, DGDG и SQDG) описано в пункте 2 и создание мицелл липидов-моющего средства с octylglycoside (ОГ). Размер определенный липид мицеллы достигается методом экструзии, с использованием определенной поры диаметром мембраны. FCP и липидов мицеллы унифицированы на предопределенные липидов: соотношение белка и моющих средств, ОГ и β-DDM будут удалены через контролируемые диализа, образуя FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Фотосинтетическая производительности растений, водорослей и диатомовые водоросли сильно зависит от быстрого и эффективного регулирования света уборки и энергии процессов переноса в тилакоидной мембране хлоропластов. Свет, уборки антенна диатомовых водорослей, так называемые фукоксантин хлорофилл кондиционера связывая протеинов (FCP), необходимые для поглощения света и эффективную передачу реакционном центров также для фото защита от чрезмерного света. Переключение между этими двумя функциями является давней проблемы исследования. Многие из этих исследований были проведены с FCP в мицеллах моющего средства. Для исследования взаимодействия были удалены моющих средств, что привело к неспецифическим агрегации FCP комплексов. В этом подходе трудно различать артефакты и физиологически соответствующих данных. Таким образом можно получить более ценную информацию о FCP и другие мембраны связаны света уборки комплексов путем изучения взаимодействий протеин протеина, передачи энергии и другие спектральные особенности, если они встроены в их среде родной липидов. Главным преимуществом является, что липосомы имеют определенный размер и соотношение определенных липидов/белков, в которой контролируется степень FCP кластеризации. Кроме того изменения в составе рН и Иона, которые регулируют света уборки в естественных условиях легко могут быть смоделированы. По сравнению с тилакоидной мембраны липосомы более однородной и менее сложным, что делает его легче получить и понять спектральные данные. Протокол описывает процедуру FCP изоляции и очистки, липосомы подготовки и включения FCP в липосомы с естественный липидный состав. Результаты от типичного приложения дают и обсуждены.

Протокол описывает изоляции всего FCP фракции от Cyclotella meneghiniana и включения в липосомы с родной липидный состав. Изоляция тилакоидов высокую воспроизводимость, но тилакоидов доходность может измениться. Результатом является приемлемым, если более 50% всех пигментов ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Здесь мы представляем протокол изолировать фукоксантин хлорофилл кондиционера связывания белков (FCP) диатомовых водорослей и включить их в липосомы с естественным липидной композиции для изучения передачи энергии возбуждения после изменения ионного состава.

Изоляция и включения светособирающего антенны от диатомовые водоросли Cyclotella Meneghiniana в липосомах с липидами тилакоидов

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Подготовка гидролизат кератина от куриные перья и его применение в косметике

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Детергент-помощь Восстановление рекомбинантных Drosophila Аластин в липосомы для Липид-смешивания анализы

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Простое производство капиллярных колонн на месте с помощью FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...