Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Vi tackar Rana Adeel Ahmad för bistånd i FCP rening. Prof. Claudia Büchel är erkänt för bra diskussioner och läsa manuskriptet. Detta arbete fick stöd av den tyska forskningsfondens till LD (DI1956-1/1) och Humboldt foundation för ett Feodor Lynen stipendium till LD.

Obs: Fotosyntetiska komplex såsom FCPs är mycket sårbara för ljus och värme. Arbeta alltid på isen och under ett mycket svagt ljus.
1. isolering av FCP från celler
<ol><li>
Tylakoida isolering från C. meneghiniana celler
	<ol>
<li>C. meneghiniana i fem 500 mL kolvar var fyllda med 300 mL ASP-medium23,25 och 50 miljoner celler att växa. Anslut kolvarna med en propp av bomull...

FCP liposomer med naturliga lipid sammansättning ger en praktisk, enkel och reproducerbara verktyg för att undersöka spektroskopiska boenden in vitro-. Lipid miljön i FCP liposomer liknar situationen inom tylakoida membranet, vilket ger upphov till experimentella resultat som är närmare naturliga förhållanden.
I området i närheten finns det flera fördelar med att använda C. meneghiniana som modellsystem för FCP antenn. Den växer relativt fort och är mer robust ...

Fotosyntetiska organismer såsom kiselalger måste klara av ständigt föränderliga ljusförhållanden och svara med sofistikerade acklimatisering mekanismer som upprätthålla hög fotosyntetiska effektivitet och skydda från foto-oxidativ skada som orsakas av överdriven ljuset. En större tända-skyddande process i photosynthetic eukaryota organismer är hög energi släcka (qE) absorberas ljus som uppstår som den främsta bidragen till den icke-fotokemiska släcka (NPQ) under lätta stress villkor1,2 ,3. De lätta skörda antenn komplex (LHC) är involverade i regleringen av magnetiseringen energi överföring vägar. Svar på höga ljus inducerad lågt pH i kloroplast lumen, växlarna antenn system från ljuset skörd staten att släcka staten. Denna energi dissipativa staten skyddar fotosystem (PS) och andra komplex i tylakoida membran från photo-oxidation. I photosynthetic eukaryota organismer framkallas qE oftast av två faktorer1,2,3. En faktor är specialiserade ljuset skörd protein som svarar på den lågt pH. Proteinet PsbS inducerar qE i högre växter4. LhcSRs5, moduleras av PsbS aktivitet, framkalla qE i grönalger6. Kiselalger äger Lhcx-liknande proteiner som strukturellt besläktade LHCSRs7,8,9,10.
Den andra faktorn qE är xanthofyll cykeln där karotenoider av antennen konverteras till en foto-skyddande form av de-epoxidering och återgått av epoxidering. I växter och gröna alger konverteras violaxanthin till zeaxantin. I kiselalger omvandlas diadinoxanthin till diatoxanthin, som sedan korrelerar med omfattningen av NPQ11. Kiselalger ljuset skörd antenn besitter vissa egenheter även om det är evolutionärt relaterade till växter och alger LHCs. Övergången från ljus skörd till foto-skydd är oerhört snabb och NPQ kapacitet är högre jämfört med växter12. Detta kan vara en orsak varför kiselalger är mycket framgångsrika i olika ekologiska nischer på ett sätt som de är ansvariga för upp till 45% av den oceaniska netto primärproduktion13. Kiselalger ljus skörd system är därför ett intressant objekt av photosynthesis forskning.
Kiselalger, liknar centrerad arten Cyclotella meneghiniana, äger tylakoida inneboende ljus skörd system uppkallad efter pigment de binda - fucoxanthin, klorofyll (chl) a och c, därav FCP. ljus skörd proteiner, såsom FCPs, är inbäddad i tylakoida membran systemet bestående av flera membran lager. Kiselalger bilda band av tre thylakoids. Detta komplex situationen gör det svårt att studera dem på molekylär nivå i tylakoida membran. Dessutom bidrar många komponenter till regleringen av ljus skörd (se ovan). Därför i många metoder isolerades komplexen från membranet använder mild rengöringsmedel, till exempel n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membranet men hålla FCP komplexen intakt. Många spektroskopiska studier utfördes med solubilized FCP för att undersöka intramolekylära energi överföring14,15,16,17. Detta före detta tillvägagångssätt var dock begränsad eftersom regleringen av energiöverföringen behöver excitonic interaktion med andra antenn komplex eller fotosystem. Därför, dessa typer av studier inte kan utföras med solubilized komplex eftersom interaktionen mellan komplex går förlorad.
Ett viktigt inslag i antenn förordning är ”molekylär trängsel” antenn och fotosystem i tylakoida membran18. Tidigare, en enkel strategi genomfördes för att simulera effekten in vitro-. Tvättmedlet togs bort, vilket leder till slumpmässiga aggregering av antenn komplex. Även om vissa rimliga uppgifter erhölls genom detta tillvägagångssätt17,19, tvättmedel avlägsnande återspeglar inte den situation i vivo och har vissa begränsningar eftersom komplexen inte interagerar i sin regelbundna tertiär struktur.
Användning av liposomer övervinner flera av de tidigare begränsningarna. Tertiär struktur är fortfarande helt intakt. Liposom membranet ger en kvasi infödda miljö för antenn komplexen. Membranet separerar insidan av Liposom från den yttre miljön. Av dessa medel ger liposomer två reaktion fack för studier av ion och pH lutningar samt när det gäller processer. Ytterligare, parametrarna för experimentell systemet kan kontrolleras lättare för studier i tylakoida membran. Liposomer har redan visat sig vara ett utmärkt verktyg att studera fotosyntetiska komplex. Ett stort fokus i förflutnan var på anläggning LHC där effekten av förändrade lipid sammansättning testades på LHC II20. I andra metoder, protein-protein interaktioner mellan olika LHC II var undersökta21. Också, vissa studier i grönalger genomfördes som beskriver spontana klustring mellan LHC22. Som beaktar betydelsen av kiselalger för akvatiska ekosystem, relativt få studier utfördes med antenn komplex av kiselalger. Två studier undersökt antenn komplexen av den centrerad Cyclotella meneghiniana, var den klustring av FCP antenn23 och lyhördhet av FCP till elektrokemiska övertoningar24 visades. Liposomer är alltså ett utmärkt verktyg att studera kiselalger antenner och deras interaktion och förordning i nästan inhemska förhållanden. Liposomer är mångsidig eftersom många förhållanden såsom lipid sammansättning, Liposom storlek, protein densitet och kringliggande vattenfasen kan styras. Metoden kräver dessutom låga mängder prover. Det experimentella systemet är robusta och mycket reproducerbara. Uppdelning i liposomer möjliggör studera pH och ion övertoningar, vilka är viktiga faktorer i regleringen av antenn komplex.
Här beskriver vi isolera FCP antenn komplex från C. meneghiniana och deras införlivande i liposomer med naturliga tylakoida lipid sammansättning. Också, vi tillhandahåller exemplariskt data för spektroskopisk karakterisering av solubilized FCP och jämföra dem med FCP i liposomer. Metoden sammanfattar kunskap och standardiserade protokoll erhålls från förbättringar av Gundermann och Büchel 201223, Natali et al. 201622och Ahmad och Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet. (1) refererar till punkt 1 och som beskriver celltillväxt, störningar och tylakoida isolering med följande FCP separation på sackaros täthetlutningar; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) beredning av naturliga tylakoida lipid blandning (MGDG, DGDG och SQDG) beskrivs i punkt 2 och skapandet av lipid-tvättmedel miceller med octylglycoside (OG). En definierad lipid-micelle storlek uppnås genom extrudering med membran av definierade pordiameter. FCP och lipid-miceller är enhetlig på en fördefinierad lipid: förhållandet mellan protein och tvätt OG och β-DDM är borttagna via kontrollerade dialys bildar FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Fotosyntetiska prestanda av växter, alger och kiselalger beror starkt på snabb och effektiv reglering av ljuset skörd och energi överföring processer i tylakoida membranet i kloroplaster. Ljuset skörd antenn av kiselalger, de så kallade fucoxanthin klorofyll a/c-bindande proteinerna (FCP), krävs för ljusabsorption och effektiv överföring till fotosyntetiska reaktionen centrerar liksom när det gäller foto-skydd mot alltför stora ljus. Växla mellan dessa två funktioner handlar mångåriga forskning. Många av dessa studier har genomförts med FCP i tvättmedel miceller. För interaktionsstudier har tvätt tagits bort, vilket ledde till en ospecifik aggregering av FCP komplex. I detta synsätt är det svårt att diskriminera mellan artefakter och fysiologiskt relevanta data. Därför kan mer värdefull information om FCP och andra membran bunden ljus skörd komplex erhållas genom att studera protein-protein interaktioner, energiöverföring och andra spektroskopiska funktioner om de är inbäddade i deras infödda lipid miljö. Den största fördelen är att liposomer har en definierad storlek och en definierad lipid/proteinkvot som omfattningen av FCP klustring är kontrollerad. Ytterligare, förändringar i pH och ion sammansättning som reglerar ljus avverkning i vivo simuleras enkelt. I jämförelse med det tylakoida membranet är liposomer mer homogen och mindre komplex, vilket gör det lättare att få och förstå spektroskopiska data. Protokollet beskrivs förfarandet FCP isolering och rening, Liposom förberedelse och införlivande av FCP i liposomer med naturliga lipid sammansättning. Resultat från en typisk tillämpning ges och diskuterade.

Protokollet beskrivs isolering av totala FCP fraktionen från Cyclotella meneghiniana och införlivande i liposomer med infödda lipid sammansättning. Tylakoida isolering är mycket reproducerbara, men tylakoida avkastningen kan ändra. Resultatet är godtagbart om mer än 50% av alla pigment återvinns i steg 1.1.4. Mer än 80% är optimal.
Lösbarhet av thylakoids är ett viktigt steg. Väl solubilized membran erhål...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera fucoxanthin klorofyll a/c-bindande proteiner (FCP) från kiselalger och införliva dem i liposomer med naturliga lipid kompositioner att studera excitation energiöverföring på ion sammansättning ändras.

Isolera och införliva ljus-skörd antenner från kiselalger Cyclotella Meneghiniana i liposomer med tylakoida lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Beredning av Keratin hydrolysat från kyckling fjädrar och dess tillämpning i kosmetika

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Enkel egen kapillärkolonntillverkning med FlashPack-metoden

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...