Name: studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

אנו מודים לכל בהווה ובעבר Kunkel מעבדה החברים על עבודתם, דיונים הקשורים פרוטוקול נתונים שהוצגו כאן לעשות בה שימוש חוזר. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Z01 ES065070 כדי T.A.K. של המחלקה של מגזר בחקר המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS).

1. אלקליין ההידרוליזה וזמינות תספיג דנ ספציפיים סטרנד (איור 1)
<ol><li>צמיחת תאים ובידוד דנ א גנומי<ol>
<li>לבודד שמרים דנ א גנומי באמצעות שמרים ערכת טיהור DNA ההוראות של היצרן. השתמש התרבויות, הן בשלב מעריכית של צמיחה בין (צפיפות אופטית של 0.5) 1. Resuspend בגדר DNA הסופי ב- 35 מ ל 1 x מאגר TE (10 מ ?...

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair.">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li><li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+Degradation+by+Specific+Base+Catalysis+of+Transesterification+Involving+the+2'-Hydroxyl+Group.">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li><li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+in+DNA:+origins,+repair+and+consequences.">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li><li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luria-Delbruck+fluctuation+experiments:+design+and+analysis.">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved.">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors.">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA.">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific.">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li><li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור שתי קבוצות של ניסויים המשמשים לעתים קרובות לנתח באופן כמותי למחצה ribonucleotides שולבו במהלך שכפול ה-DNA ואת ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides לא מתוקן. למרות גישות אלה כוללות את מודל איקריוטים cerevisiae ס, טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות על חיידקים ועל פרוקריוטים ג?...

במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים, ribonucleotides משולבים הגנום על ידי כל שלוש הגדולות DNA replicases, אן polymerases (Pols) α, חדוה אלפא1,2. RNase תלויי-H2 ribonucleotide כריתה תיקון (RER3) מסיר את רוב אלה ribonucleotides מוטבע.
Ribonucleotide ב- DNA היא חשופה הידרוליזה, כמו 2' קבוצת הידרוקסיל של moiety הסוכר יכול לתקוף את סמוכים פוספודיאסטרי, שחרור קצה אחד עם 2 - 3' פוספטים מחזורית והשני עם 5'-OH4. תנאי בסיסי מאוד יכולים להאיץ את התגובה הזו. לפיכך, הידרוליזה של ribonucleotides מוטבע במהלך הדגירה בפתרון בסיסי גורם פיצול של הדנ א, אשר ניתן לאבחן על ידי אלקטרופורזה אלקליין agarose5. את הדנ א ניתן להעביר קרום, שנבדק על ידי ניתוח תספיג דנ א באמצעות הגששים סטרנד ספציפיים המאפשרים זיהוי אתרים אלקליות רגיש נגרם על-ידי ribonucleotides משולבים לתוך nascent המובילים - או לקרטע-סטרנד ה-DNA, בהתאמה.
תאי שמרים חסר פעילות RNase H2, הסרה של ribonucleotides יכול להיות יזם כאשר טופואיזומראז (Top1) אני גונבת דנ א ב6,ribonucleotide מוטבע7. עם זאת, כשאתה Top1 cleaves בקצה 3' של ribonucleotide, זה יוצר 5'-הו ומסתיים 2' - 3' פוספט מחזורית DNA כי הם דברים מעוותים religation. כשל תיקון, או חריגה עיבוד קצות אלה' מלוכלך' יכול להוביל אי יציבות גנומית. בנוסף, אם החתך מתבצע בתוך רצף הדנ א. אני חוזר, תהליך התיקון יכול להוביל מוטציות מחיקה. זה בעייתי במיוחד עבור טנדם חוזר, איפה קצר מחיקות (של בין זוגות בסיס וחמש) בדרך כלל שנצפו בתאי RNase H2 לקויה. תלוי Top1-השפעות מזיקות בהיעדרו של שמרים H2 RNase פעילות הם החמירו ב- DNA פולימראז חדוה מוטציה (pol2-M644G) מופקר על התאגדות ribonucleotide במהלך סינתזה גדיל מוביל המתהווה.
עיבוד של ribonucleotides בדנ א מוביל מוטציות ספונטניות, מוטגנזה מכוונת זו ניתן להבחין באמצעות הכתבת המתאימים גנים ובחירה עבור השינוי פנוטיפי הנלווה. מבחן תנודות או ניסוי לוריא, דלבריק הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר למדוד את המחירים מוטציה ספונטנית באמצעות כתב לבחירה על ידי גנים8,9. בשמרים, הגנים URA3 , CAN1 יכול לשמש עיתונאים ב וזמינותו מוטציה קדימה, המאפשר איתור כל סוגי מוטציה שתוצאתה אובדן התפקוד ג'ין. קצב מוטציה ספונטנית מוערך כמו החציון של זה נצפתה לגבי תרבויות רבות במקביל החלה מ מושבות יחיד ללא מוטציות בגן כתב היעד. שמרים RNase H2 לקויה זן כגון Δ rnh201יש קצב מוטציה ספונטנית בסך הכל במתינות מוגברות נגרמת בעיקר על ידי שכיחות גבוה של 2-5 מחיקות bp במשולב לחזור על רצפים. לפיכך, לאפיין באופן מלא את ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides הגנום, המוטציה המחירים צריך להיקבע. במקרה זה, הגנים כתב URA3 או CAN1 יכול להיות מוגבר וסודרו כדי לקבוע את סוגי והמיקומים של מוטציות ו המוטציה המחירים יכול להיות מחושב. הידור מוטציות. שזוהו מספר מוטציות URA3 או CAN1 עצמאית ואז ניתן ליצור קשת מוטציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &#8211; 35 ml per plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAN plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 56 &#176;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 60 &#176;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>F5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass culture tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture rotator in 30 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shaker incubator can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm glass beads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>MPY80200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Newer model available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Dot Scientific Inc.</td>
			<td>DSF10400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Eastman</td>
			<td>6356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>International Technologies Inc.</td>
			<td>72120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 MM CHR Chromotography paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7560-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-25 spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NaH2PO4 (S9638); 
			Na2HPO4 (S9390)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

הנוכחות של ribonucleotides ב DNA גרעיני הוכח להיות מקור של אי יציבות גנומית. היקף ההתאגדות ribonucleotide יכול להיות מוערך על ידי הידרוליזה אלקליין, ג'ל אלקטרופורזה כמו ה-RNA הוא רגישים מאוד הידרוליזה בתנאים אלקליין. זה, בשילוב עם ניתוח תספיג דנ א יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום לנטישה לתוך אשר ribonucleotides כבר שילבו. עם זאת, הליך זה היא רק חצי כמותית ולא ניתן רגישים מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בתוכן ribonucleotide, למרות סטרנד ספציפיים תספיג חיטוט משפר את הרגישות. כאמצעי של אחת ההשלכות ביולוגי הבולט ביותר של ribonucleotides ב- DNA, מוטגנזה מכוונת ספונטנית ניתן לנתח באמצעות וזמינותו של מוטציה קדימה. באמצעות כתב המתאים גנים, מוטציות נדירות שתוצאתו אובדן התפקוד יכול להיות שנבחרו, הכוללת, המוטציה המחירים נמדד על ידי שילוב הנתונים של תנודות ניסויים עם רצפי DNA של הגן הכתב. וזמינותו תנודות ישימה לבחון מגוון רחב של תהליכים מוטגניות רקע גנטי מסוים או תנאי הגידול.

טיפול ה-DNA גנומי עם אלקליות ואחריו בג'ל אלקליין מאפשרת גילוי חצי כמותית של DNA במבנה השביר עקב שפע ribonucleotides stably incorporated. איור 2 מציג את התמונות ג'ל של שמרים דנ א גנומי מטופלים עם או בלי קו5. גרסה M644L של Pol2, יחידת משנה קטליטי של Polε, הפחיתה את היכולת לשל...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...