Name: the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da assegni di ricerca di facoltà dall'ufficio il College delle arti e del preside di Scienze presso l'Università di Hartford.

Durante lo studio, trattamento e cura degli animali in osservanza politica National Institutes of Health, erano in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e cura animali istituzionale degli animali Università di Hartford.
1. trascinamento degli animali
Nota: Venti settimana-vecchio maschio B6129SF2/J topi sono usati nello studio.
<ol><li>Salire sul treno topi per una 12 ore di luce (luce standard testa bianca) / 12h...

<ol>
	<li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators:+lessons+from+diverse+organisms.">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li><li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+Peripheral+Circadian+Clocks+in+Mammals.">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes.">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li><li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oscillations+in+expression+and+responsiveness+of+Toll-like+receptors+in+splenic+immune+cells.">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579 (2018).</li></ol>

All'interno di questo protocollo, uno spettrofotometro di microvolume può essere utilizzato per quantificare e valutare la purezza del RNA utilizzato nel determinare l'espressione genica. Acidi nucleici assorbono UV luce a 260 nm, proteine in genere assorbono la luce a 280 nm, mentre altri potenziali contaminanti utilizzati durante una procedura di estrazione di RNA (ad es., fenolo) sono rilevabili a 230 nm. Pertanto, valutando l'assorbanza (A) rapporto a 260/280 nm (RNA alla proteina) e 260/230 nm (RNA a prote...

Il master clock nei mammiferi, che orchestra oscillazioni 24h per quasi tutti gli aspetti della fisiologia e del comportamento, si trova all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo1,2. Oltre alla regolazione di processi biologici a livello organico, il master clock sincronizza anche periferici Orologi Cellulari in tutto il corpo3,4,5. Mentre il macchinario di orologio molecolare è costituito da almeno tre cicli di feedback trascrizionale traslazionale ad incastro, il nucleo è composto il periodo (Per1-3), crittocromo (Cry1-2), Bmal1, e orologio geni6,7. Oltre a mantenere la tempistica accurata dell'orologio molecolare core, anche alcuni prodotti del gene orologio accessorie (ad es., Rev-erbα e Dbp) regolano l'espressione dei geni dell'orologio non, cioè, orologio geni controllati (GCC)6 , 7.
Orologi molecolari funzionali sono state descritte in vari tessuti immuni (ad es., milza e linfonodi)8 e cellule (ad es., B cellule, cellule dendritiche, macrofagi)8,9. Queste cellule rilevare e rispondere ai pattern molecolari associati (PAMPs), conservati componenti microbici, attraverso recettori di riconoscimento immune innata come recettori Toll-like (TLR)10. Ad oggi, sono stati descritti 13 funzionale TLR, che riconoscono costituenti microbici quali componenti della parete cellulare batterica, proteina fustigatrice e acidi nucleici microbici10. La PAMP, lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, riconosciuto da TLR4, è stato indicato per alterare i ritmi circadiani a livello sia organismica e molecolare. Ad esempio, in vivo sfida di LPS indotto da ritardi di fase fotica-come misurata dall'attività in topi11 e portato a orologio ridotta espressione genica nel SCN e nel fegato come determinato mediante ibridazione in situ e PCR quantitativa, rispettivamente, in ratti12. Dopo una sfida in vivo con LPS, analisi del sangue periferico umano leucociti13 e tessuto adiposo sottocutaneo14 ha rivelato alterata espressione di diversi geni dell'orologio come misurato tramite qPCR. Infine, ex vivo sfide LPS di macrofagi umani e macrofagi peritoneali del topo, inoltre ha condotto ad alterata espressione dell'orologio come misurato da qPCR14.
Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'influenza dei LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucleotidi sintetici contenenti unmethylated CpG motivi) e calore-ucciso Listeria monocytogenes (HKLM), riconosciuto da TLR4, TLR9 e TLR2, rispettivamente, il espressione genica di orologio molecolare negli splenocytes del topo. Il protocollo comprende lo splenectomy mouse, isolamento splenocyte e sfida, RNA estrazione, sintesi del cDNA e qPCR per valutare l'espressione di diversi geni dell'orologio. Questo protocollo permette l'acquisizione tempestiva di un gran numero di cellule del sistema immunitario con molto piccolo animale o manipolazione cellulare, che può quindi essere contestato ex vivo con vari PAMPs. L'orologio molecolare è stato indicato per modulare i vari aspetti della risposta immunitaria8,15,16, pertanto, rottura dell'orologio molecolare molto probabilmente potrebbe compromettere la corretta variazione dipendente dal tempo della risposta immunitaria. Inoltre, poiché le interruzioni dei ritmi circadiani possono portare a gravi patologie17,18,19,20, può essere di interesse per i ricercatori di sfidare gli splenocytes con una vasta gamma di molecole e valutare la loro influenza sull'orologio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

Dal comportamento di espressione genica, i ritmi circadiani regolano quasi tutti gli aspetti della fisiologia. Qui, presentiamo una metodologia per sfidare splenocytes del topo con il pattern molecolari associati (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), il ODN1826 e il calore-ucciso Listeria monocytogenes ed esaminare il loro effetto su molecolare circadiano orologio. In precedenza, studi si sono concentrati sull'esame l'influenza di LPS sull'orologio molecolare usando una varietà di approcci in vivo ed ex vivo da un assortimento di modelli (ad es., topo, ratto e umani). Questo protocollo descrive l'isolamento e la sfida di splenocytes, nonché la metodologia per valutare la post-sfida espressione di gene di orologio tramite PCR quantitativa. Questo approccio può essere utilizzato per valutare non solo l'influenza di componenti microbiche sull'orologio molecolare ma anche altre molecole che può alterare l'espressione dell'orologio. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per prendere in giro a pezzi il meccanismo molecolare di come l'interazione di PAMP-Toll-like receptor influenza espressione dell'orologio.

Topi sono stati sacrificati a ZT13, splenocytes sono stati isolati e contestato ex vivo con il LPS PAMPs, ODN1826 o HKLM. Dopo 3 h, RNA è stato isolato e qPCR è stato utilizzato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni orologio molecolare orologio, Per2, Dbp e Rev-erbα rispetto alle cellule di controllo incontrastato. Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione di Clock non erano significativamente differenti che l'e...

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The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Questo protocollo descrive una tecnica usando splenocytes del topo per scoprire pattern molecolari associati che alterano l'espressione genica di orologio molecolare.

L'uso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sull'espressione del Gene dell'orologio

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

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