Name: the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00
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この作業によって支えられた教員研究費ハートフォード大学の教養と科学学部長のオフィスから。

調査中, 動物のケアと治療国立衛生研究ポリシー遵守制度のガイドラインに従って, ハートフォード大学動物施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 動物の同調
メモ: 20 週齢雄 B6129SF2/J マウスの研究で使用します。
<ol><li>マウスに 12 h 光 (標準的なオーバーヘッド白色光) を同調/12 h 暗いサイクル実験開始前 2 週間。 注: ここで...

<ol>
	<li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators:+lessons+from+diverse+organisms.">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li><li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+Peripheral+Circadian+Clocks+in+Mammals.">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. 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N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages,+dendritic+cells,+and+B+cells.">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors.">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li><li>Marpeg&#225;n, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. 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Res. 145, 5-12 (2008).</li><li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes.">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li><li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1.">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li><li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity.">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li><li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+receptor+REV-ERB+&#945;+mediates+circadian+regulation+of+innate+immunity+through+selective+regulation+of+inflammatory+cytokines.">The nuclear receptor REV-ERB &#945; mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li><li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+abnormalities.">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li><li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+disruption+and+cancer:+sleep+and+immune+regulation.">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li><li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock:+pacemaker+and+tumour+suppressor.">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li><li>Germain, A., Kupfer, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes.">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li><li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oscillations+in+expression+and+responsiveness+of+Toll-like+receptors+in+splenic+immune+cells.">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579 (2018).</li></ol>

このプロトコルでは、定量化し、遺伝子の発現を決定する際に使用されている RNA の純度を評価する微量分光光度計を使用できます。核酸は 260 で紫外線を吸収する nm、蛋白質は通常 280 で光を吸収する nm、RNA 抽出プロシージャ (例えばフェノール) 中に使用される他の潜在的な汚染物質が 230 で検出可能な nm。したがって、吸光度 260/280 (、) の比を評価することにより nm (蛋白質に RNA) ?...

生理学および行動のほぼすべての側面の 24 h 振動を調整、哺乳類で、マスターのクロックは視床下部1,2の視交叉上核 (SCN) 内にあります。個体レベルでの生物学的プロセスを制御する、に加えてマスター時計はまた体3,4,5を通じて末梢細胞時計を同期します。コアは、期間(Per1 3)、クリプト(Cry1 2)、 Bmal1で構成されています一方、分子時計の機械は少なくとも 3 つの連動転写翻訳フィード バック ループから成っている、時計遺伝子6,7.コア分子時計の正確なタイミングを維持する以外にもいくつかの補助的な時計遺伝子産物 (例えば、試とDbp) はまた非時計遺伝子の発現を調節する、すなわち、時計被制御遺伝子 (CCGs)6,7。
機能分子時計は、様々 な免疫組織 (例えば、脾臓およびリンパ節)8と細胞 (例えば、 B 細胞、樹状細胞、マクロファージ)8,9に記載されています。これらの細胞は検出し、病原体関連分子パターン (PAMPs)、Toll 様受容体 (Tlr)10などの自然免疫認識受容体を介して、保存された微生物のコンポーネントに対応します。これまで、細菌の細胞壁構成成分、べん毛タンパク質は、微生物の核酸10など微生物の成分を認識する、13 の機能的な Tlr が記載されています。種緑化、リポ多糖 (LPS)、TLR4、によって認識されるグラム陰性菌の細胞壁の成分は、生物・分子レベルでの概日リズムを変更する示されています。たとえば、組合の生体内で挑戦の閃光のような位相遅延マウス11の活動によって測定されると SCN と肝臓の in situハイブリダイゼーションおよび量的な PCR によって決定される減らされた時計遺伝子発現につながったそれぞれのラットの12を実行します。組合の指定する生体内で挑戦後、ひと末梢血白血球13と皮下脂肪14の分析は、qPCR を介して測定としていくつかの時計遺伝子の発現の変化を明らかにしました。最後に、ヒトのマクロファージともにつながったマウス腹腔マクロファージの LPS 挑戦前のヴィヴォ時計式 qPCR14によって測定されるように変更。
ここでは、ODN1826 (を含む総合的なオリゴヌクレオチド非メチル化 CpG モチーフ)、PAMPs LPS の影響を評価するためのプロトコルについて述べると熱殺されたリステリア菌(HKLM)、TLR4、TLR9、TLR2、認識にそれぞれ、マウス脾細胞における分子時計遺伝子発現。マウス脾臓摘出術、卵白アルブミンの分離とチャレンジ、RNA 抽出、cDNA 合成、qPCR いくつか時計遺伝子の発現を評価するために、プロトコルが含まれます。このプロトコルは、非常に小さな動物に免疫細胞の数が多いのタイムリーな取得またはすることができますし、携帯電話の操作は前のヴィヴォ様々 な PAMPs と挑戦します。免疫応答8,15,16のさまざまな側面を調節する分子時計が示されている、したがって、分子時計の破壊の適切な時間に依存した変動損なう可能性が高く、免疫応答。さらに、概日リズムの混乱は深刻な病態17,18,,1920につながることができます、のでそれがあります脾細胞の広い範囲に挑戦する研究者にとっての分子時計への影響を評価します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

遺伝子発現への動作は、概日リズムは、生理学のほぼすべての側面を調節します。ここでは、病原体関連分子パターン (PAMPs) リポ多糖 (LPS)、ODN1826、熱殺されたリステリア菌とマウス脾細胞に挑戦し、概日リズムの分子の影響を検証する手法を提案します。時計。以前は、研究はさまざまなモデル (例えばマウス、ラットおよび人間) の品揃えから体内と体外のアプローチを使用して分子時計に LPS の影響を調べることに焦点を当てています。このプロトコルでは、分離と定量的 PCR によって時計遺伝子発現後挑戦を評価する方法論と同様に、脾細胞の挑戦をについて説明します。このアプローチは、だけでなく時計の表現を変えることができると同様に他の分子が、分子時計に微生物成分の影響を評価するために使用することができます。このアプローチは、時計式に影響を与える種緑化トール様受容体相互作用の分子機構をいじめる離れて利用できます。

マウスが ZT13 で犠牲になった、脾細胞が隔離され前のヴィヴォPAMPs LP、ODN1826、または HKLM に挑戦します。3 h 後 RNA が分離され、qPCR 比類のない制御の細胞と比較して試、 Dbp、 Per2時計分子時計遺伝子の相対発現レベルを評価するために使用されました。種緑化挑戦後、時計式レベルは制御の細胞 (図 1<stron...

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The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

このプロトコルでは、マウスの脾細胞を使用して分子時計遺伝子発現を変更、病原体関連分子パターンを発見する手法について説明します。

時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

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A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

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