Name: the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression at JoVE.com

이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.

연구 기간 동안 동물 보호 및 치료 건강의 국가 학회 정책 준수, 기관 지침에 따라 되었고 하트포드의 대학 동물 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 동물의 유입
참고: 20 주 된 남성 B6129SF2/J 쥐 연구에 사용 됩니다.
<ol><li>쥐 라이트 12 h (표준 오버 헤드 화이트 빛)를 끌고가 다/어두운 12 h 주기 2 주 전에 실험에 대 한. 참고: 여기 ze...

<ol>
	<li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators:+lessons+from+diverse+organisms.">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li><li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+Peripheral+Circadian+Clocks+in+Mammals.">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. 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이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오?...

생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, 즉, 시계 제어 유전자 (CCGs)6 , 7.
기능성 분자 시계 다양 한 면역 조직 (예를 들어, 비장 및 림프절)8 셀 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대 식 세포)8,9에서 설명 했습니다. 이 세포를 감지 하 고 응답 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs), 수용 체 통행세 같이 (TLRs)10등 타고 난 면역 인식 수용 체를 통해 보존된 미생물 구성 요소. 날짜 하려면, 13 기능 TLRs는 설명, 세균성 세포 벽 구성 요소, flagellar 단백질, 핵 산 미생물10등 미생물 성분 인식 하는. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), TLR4에 의해 인식 하는 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 organismal와 분자 수준에서 circadian 리듬 변경 표시 되었습니다. 예를 들어 vivo에서 LPS의 빛 같은 위상 지연 마우스11 활동에 의해 측정 된 유도 도전과 SCN에 간 현장에서 교 잡 그리고 양이 많은 PCR에 의해 결정으로 감소 된 시계 유전자 발현에 쥐12에서 각각. vivo에서 도전 LPS와, 후 인간의 말 초 혈액 백혈구13 및 피하 지방 조직14 의 분석 통해 정량 측정으로 여러 시계 유전자의 바꾸 인된 표현을 밝혔다. 마지막으로, 인간의 세포와도 마우스 복 막 대 식 세포의 LPS 도전 비보 전 시계 식 정량14측정으로 변경.
여기, 우리 PAMPs LPS, ODN1826 (를 포함 하는 합성 oligonucleotides CpG 모티브 unmethylated)의 영향을 평가 하기 위해 프로토콜 설명 및 열 죽 Listeria monocytogenes (HKLM)에 의해 인식 TLR4, TLR9, 그리고 TLR2, 각각,에 분자 시계 유전자 식 마우스 splenocytes에. 프로토콜에는 마우스 splenectomy splenocyte 격리 및 도전, RNA 추출, cDNA 합성, 정량 여러 시계 유전자의 표정을 평가 하 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜 면역 세포와 아주 작은 동물의 많은 수의 적시 취득 또는 세포 조작, 다음 수 있는 비보 전 다양 한 PAMPs와 도전. 분자 시계 변조 면역 응답8,,1516의 다양 한 측면을 보여줘 왔다, 그러므로, 분자 시계의 대부분의 적절 한 시간에 따른 변형 자유로울 것는 면역 응답입니다. 또한, 이후 circadian 리듬의 붕괴는 심각한 병 리17,18,,1920으로 이어질 수 있습니다., 그것은 연구자 도전 splenocytes의 넓은 범위에 대 한 관심의 있을 수 있습니다. 분자 시계에 그들의 영향을 평가 하 고.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.

마우스 ZT13에 희생 했다, splenocytes 고립 된 비보 전 PAMPs LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 3 h 후 RNA 격리, 고 정량 시계, Per2, Dbp, 및 레 브 erbα 당된 컨트롤 셀에 비해 분자 시계 유전자의 상대 식 수준을 평가 하는 데 사용 되었다. PAMP 도전 후 시계 식 레벨 제어 셀 (그림 1A) 식 보다 크게 다른 되지 않았습니?...

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The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

연구

유전학

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

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생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

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