Name: the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela pesquisa de faculdade concede do escritório da faculdade de artes e Ciências do reitor na Universidade de Hartford.

Durante o estudo, tratamento e cuidados com animais cumprido com a política do National Institutes of Health, estavam em conformidade com as orientações institucionais e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional Animal Universidade de Hartford.
1. o arrastamento de animais
Nota: Vinte semanas masculino B6129SF2/J os ratos são usados no estudo.
<ol><li>Arrastar os ratos para um 12 h luz (padrão sobrecarga luz branca) / ciclo de 12h esc...

<ol>
	<li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators:+lessons+from+diverse+organisms.">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li><li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+Peripheral+Circadian+Clocks+in+Mammals.">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes.">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li><li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oscillations+in+expression+and+responsiveness+of+Toll-like+receptors+in+splenic+immune+cells.">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579 (2018).</li></ol>

Neste protocolo, um espectrofotômetro microvolume pode ser usado para quantificar e avaliar a pureza do RNA sendo usado para determinar a expressão do gene. Ácidos nucleicos absorvem UV luz em 260 nm, proteínas normalmente absorvem luz em 280 nm, enquanto outros contaminantes potenciais usados durante um procedimento de extração de RNA (por exemplo, fenol) são detectáveis em 230 nm. Portanto, avaliando a absorvância (A) relação em 260/280 nm (RNA à proteína) e 260/230 nm (RNA de contaminantes não p...

O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período (Per1-3), prevenção (Cry1-2), Bmal1, e relógio genes6,7. Além de manter a altura exata do relógio molecular núcleo, alguns produtos de genes do relógio auxiliares (por exemplo, Rev-erbα e Dbp) também regulam a expressão de genes não-tempo, ou seja, clock genes controlados (CCGs)6 , 7.
Funcionais relógios moleculares têm sido descritos em vários tecidos imune (por exemplo, baço e linfonodos)8 e células (por exemplo, B células, as células dendríticas, macrófagos)8,9. Estas células detectam e respondem a padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), componentes microbianos conservadas, via receptores de reconhecimento imune inata como receptores Toll-like (TLRs)10. Até à data, têm sido descritos 13 TLRs funcionais, que reconhecem constituintes microbianos, como componentes da parede celular bacteriana, flagelar proteínas e ácidos nucleicos microbial10. O PAMP, lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, reconhecido por TLR4, foi mostrado para alterar o ritmo circadiano nos níveis de organismos e moleculares. Por exemplo, na vivo desafio de LPS induzido atrasos fótica-como fase medido pela atividade em ratos11 e levou à expressão do gene relógio reduzida no SCN e no fígado, conforme determinado pela hibridação in situ e PCR quantitativo, respectivamente, em ratos,12. Depois de um desafio na vivo com LPS, análise de leucócitos do sangue periférico humano13 e tecido adiposo subcutâneo14 revelou expressão alterada de vários genes de relógio, medido através de qPCR. Por último, ex vivo desafios LPS de macrófagos humanos e macrófagos peritoneais de rato, também levados a alteraram a expressão relógio medida pelo qPCR14.
Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a influência dos PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleotídeos sintéticos contendo unmethylated motivos CpG) e matou o calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconhecido por TLR4 e TLR9 TLR2, respectivamente, na expressão gênica de relógio molecular em splenocytes de rato. O protocolo inclui esplenectomia rato, isolamento de splenocyte e desafio, RNA extração, síntese do cDNA e qPCR para avaliar a expressão de vários genes do relógio. Este protocolo permite a aquisição atempada de um grande número de células do sistema imunológico com muito pouco animal ou manipulação celular, que pode então ser desafiado ex vivo com diversos PAMPs. O relógio molecular tem sido mostrado para modular a vários aspectos da resposta imune8,15,16, portanto, interrupção do relógio molecular provavelmente iria prejudicar a adequada variação dependente do tempo da resposta imune. Além disso, uma vez que as perturbações do ritmo circadiano podem levar a graves patologias17,18,19,20, pode ser de interesse para os investigadores desafiar splenocytes com uma ampla gama de moléculas e avaliar sua influência sobre o relógio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

De comportamento de expressão gênica, ritmos circadianos regulam quase todos os aspectos da fisiologia. Aqui, apresentamos uma metodologia para desafiar splenocytes de rato com o lipopolissacarídeo (PAMPs) de padrões moleculares associados patógeno (LPS), ODN1826 e calor-matou Listeria monocytogenes e examinar seu efeito sobre o molecular circadian pulso de disparo. Anteriormente, estudos têm focado a analisar a influência dos LPS do relógio molecular, usando uma variedade de abordagens in vivo e ex vivo de uma variedade de modelos (por exemplo, rato, rato e humanos). Este protocolo descreve a isolação e o desafio de splenocytes, bem como a metodologia para avaliar a expressão de gene de relógio pós-desafio através de PCR quantitativo. Esta abordagem pode ser usada para avaliar não só a influência de componentes microbianos do relógio molecular mas também outras moléculas que podem alterar a expressão do relógio. Esta abordagem poderia ser utilizada para arreliar distante o mecanismo molecular de como interação de PAMP-Toll-like receptor influencia a expressão do relógio.

Os ratos foram sacrificados em ZT13, splenocytes foram isoladas e desafiou ex vivo com o LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Depois de 3 h, RNA foi isolado, e qPCR foi usada para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relógio molecular relógio, Per2, Dbp e Rev-erbα em comparação com células de controle sem contestação. Após o desafio PAMP, níveis de expressão de relógio não foram significativamente diferentes do que a...

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The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.

O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genética

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Um método para estudar o polimorfismo C924T do Gene do Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...