Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) destruktionsbestemmelser af den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRU), af konkurrencedygtige forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fond, Laura og Arthur Colwin begavet sommer Research Fellowship Fund , Fischbach stipendium, og den store Generation fond af den Marine biologiske laboratorium og den nationale Xenopus ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del af dette arbejde blev udført. Vi takker også CERCA Program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte. A.L. er en Serra Húnter fyr.

Alle procedurer blev godkendt af det animalske videnskabsetisk komité på University of Barcelona.
Bemærk: X. tropicalis og X. laevis haletudser opdrættes efter standardmetoder13,14. Haletudse vand er udarbejdet ved at tilføje kommercielle salte (Se Tabel af materialer) til vand ved omvendt osmose. Ledningsevne er tilpasset til ∼700 µS og ∼1, 400 µS for X. tropicalis</em...

<ol>
	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+olfactory+placode+on+the+development+of+the+brain+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Axonal+growth+and+connections+of+the+transplanted+olfactory+placode.">Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-grained+fate+maps+for+the+ophthalmic+and+maxillomandibular+trigeminal+placodes+in+the+chick+embryo.">Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo.</a> Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).</li><li>Friedrich, R. W., Korsching, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+and+chemotopic+odorant+coding+in+the+zebrafish+olfactory+bulb+visualized+by+optical+imaging.">Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging.</a> Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis.">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Koide, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neural+circuitry+for+attraction+to+amino+acids+revealed+by+transposon-mediated+gene+trap+approach+in+zebrafish.">Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).</li><li>Truszkowski, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System.">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li><li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).</li><li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Dette papir beskriver teknikker, der er nyttige til at undersøge funktionaliteten af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser. Den nuværende protokol er især nyttigt for de laboratorier, der arbejder, eller har adgang til Xenopus; Det er imidlertid også interessante for de forskere, der studerer det cellulære og molekylære grundlag af neuronal regenerering og reparation. Resultaterne fra Xenopus kan kombineres med data indsamlet i andre hvirveldyr modeller til at identificere bevare...

Xenopus haletudser udgør en fremragende dyremodel for at studere den normale funktion af nervesystemet. Gennemsigtighed, fuldt sekventeret genom1,2og tilgængelighed til kirurgisk, elektrofysiologiske og Billeddannende teknikker er unikke egenskaber af Xenopus larver, der giver mulighed for at undersøge neuronal funktioner in vivo3 . Nogle af flere eksperimentelle mulighederne for dette dyr model er illustreret ved de grundige undersøgelser udført på haletudse sensoriske og motoriske systemer4,5,6. En særlig velegnet neuronal kredsløb til at studere mange aspekter af informationsbehandling på niveauet af synapser er Xenopus haletudse olfaktoriske system7. For det første, dens synaptisk forbindelse er veldefineret: olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) projekt til olfaktoriske pære og etablere synaptic kontakter med dendritter af mitral/tuftet celler i glomeruli at generere lugt kort. For det andet genereres dens ORNs kontinuerligt af neurogenese hele livet at opretholde funktionaliteten af olfaktoriske veje8. Og for det tredje fordi det olfaktoriske system viser en stor regenerative evne, Xenopus haletudser er købedygtig helt reformere deres lugtekolben efter ablation9.
I dette papir beskriver vi tilgange, der kombinerer billeddannelse af olfaktoriske glomeruli i levende haletudser med adfærdsmæssige eksperimenter til at studere funktionaliteten af olfaktoriske veje. Metoderne detaljeret her blev brugt til at studere den funktionelle genopretning af glomerulær connectivity i de olfaktoriske pære efter lugtenerven transection10. Oplysninger indhentet i Xenopus haletudser er repræsentant for hvirveldyr da olfaktoriske forarbejdning er evolutionær bevares.
De beskrevne metoder er eksemplificeret ved hjælp af X. tropicalis , men de kan nemt implementeres i X. Bærmispel. Trods den større størrelse af voksen X. laeviser begge arter bemærkelsesværdigt ens haletudse gennemførelsesstadier. De væsentligste forskelle findes på genomisk niveau. X. laevis viser dårlig genetiske sporbarhed, overvejende bestemt af sin allotetraploid genom og lange generationstid (ca 1 år). Derimod er X. tropicalis mere modtagelig for genetiske modifikationer på grund af dens kortere generationstid (5-8 måneder) og diploide genom. De repræsentative eksperimenter er illustreret for wild-type dyr og tre forskellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder, der er skitseret i det nuværende arbejde bør overvejes sammen med de genetiske skrider frem i feltet Xenopus . Enkelhed og nem implementering af de teknikker præsenteret gør dem særligt nyttigt for evaluering allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereret af CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi også beskrive en kirurgisk procedure, der anvendes til Transekttællinger olfaktoriske nerver, der kan gennemføres i et laboratorium, der har adgang til Xenopus haletudser. Metoderne anvendes for at vurdere præsynaptiske calcium svar og olfaktoriske-styrede adfærd kræver specifikke udstyr, omend på en moderat omkostninger. Metoder er præsenteret i en simpel formular til at fremme deres anvendelse i forskningsgrupper og kunne angive grundlaget for mere komplekse assays, enten ved at gennemføre forbedringer eller ved association til andre teknikker, dvs, histologiske eller genetiske metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet. De giver flere eksperimentelle fordele, såsom adgang til talrige imaging tilgange, elektrofysiologiske teknikker og adfærdsmæssige assays. Xenopus haletudse olfaktoriske system er særlig velegnet til at undersøge funktionen af synapser etableret under normale udvikling eller reformeret efter skade. Her, vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver. Vi skitsere en kombination af in vivo målinger af præsynaptiske calcium svar i glomeruli af olfaktoriske pære med olfaktoriske-styrede adfærd assays. Metoder kan kombineres med transection af olfaktoriske nerver at studere rewiring af synaptisk forbindelse. Eksperimenter er præsenteret ved hjælp af både vilde-typen og genetisk modificerede dyr udtryk for normal god landbrugspraksis journalister i centralnervesystemet celler. Anvendelsen af metoderne til genetisk modificerede haletudser beskrevne kan være nyttige for optrævler det molekylære grundlag, der definerer hvirveldyr adfærd.

I dette papir, præsenterer vi en kombination af to komplementære metoder til at udføre i vivo undersøgelse af funktionaliteten af Xenopus haletudse olfaktoriske system: Jeg) en metode for imaging præsynaptiske Ca2 + ændringer i glomeruli af levende haletudser ved hjælp af en fluorescerende calcium indikator, og ii) guidede en lugt adfærdsmæssige analyse, der kan bruges til at undersøge svar på specifikke vandbårne duftstoffer. Da disse tilgange har...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionel evaluering af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser

Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet in vivo. Vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver paa normale opdræt eller efter skade.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Denne metode kan være nyttig til at besvare centrale spørgsmål i neurobiologi områder såsom hvordan presynaptic terminaler fungerer in vivo. Den største fordel ved dette sæt af teknikker er, at vi viser gratis tilgange til æsler funktionen af olfaktoriske veje ved hjælp af Xenopus tadpoler som dyremodel. Demonstrere denne procedure vil være mig selv, Beatrice Terni, og Paolo Pacciolla.10. gang i transection-proceduren ved at befuske to stykker kvalitativt filterpapir af cellulose i 0,02%MS2 22 bedøvelsesmiddelopløsning og placere dem under dissekeringsområdet. Vælg derefter en tadpole fra tanken og nedsænkes i en skål af bedøvelsesmiddelopløsning. Tadpolen skal stoppe med at svømme inden for to til fire minutter.Kontroller for korrekt bedøvelse ved fraværet af en reaktion på mekaniske stimuli anvendes på halen niveau ved hjælp af pincet. Anlæg den bedøvede tadstud på filterpapiret under anvendelsesområdet. Placer dyret med sin dorsale side vender opad, så hjernens strukturer kan visualiseres.For adfærdsmæssige eksperimenter, bruge veni saks til at transect begge nerver til at undertrykke alle odorant oplysninger, der ankommer til olfaktoriske pære. Læg en poled glas pipette med to mikroliter calcium grøn en dextrinopløsning, og læg den i mikroinjektoren. Placer en bedøvet tadpole under dissekerende mikroskop på filterpapir, derefter flytte spidsen af pipetten ind i den vigtigste hulrum i næsekapslen, og levere 0,15 til 0,3 mikroliter af farvestoffet.Lad tadspolen være på plads i to til tre minutter. Ved hjælp af en Pasteur pipette drypper 0,02% MS2 22 opløsning på de mere kodælledele af dyret for at undgå tørring. Overfør dyret til bjærgningstanken, hvor tadspolen skal genvinde normal svømning inden for 10 minutter eller deromkring.Overhold lysstof i niveauet af det glomerulære lag af olfaktoriske pære dagen efter injektionen. Forbered en bedøvet tadpole til billedbehandling ved først at fjerne huden over olfaktoriske pære. Brug veni saks til at foretage en lateral snit på tadpole hud på kanten af centralnervesystemet på niveau med olfaktoriske pære.Undgå at udvide snittet til tectum, som let kan identificeres ved placeringen af synsnerven. Hold dyret fugtigt ved at anvende dråber på 0,02% MS2 22 opløsning ved hjælp af en Pasteur pipette derefter knibe den afskårne hud ved hjælp af pincet og trække det over nervesystemet. Kontroller vellykket fjernelse ved fravær af melanocytter over olfaktoriske pære.Placer skalt i brønden af cellen vagt belagt fad. Placer et glasdæksel slip belagt med højt vakuum fedt til at dække toppen af tectum til enden af halen. Sørg for, at olfaktoriske pære og placodes forbliver udsat for det ekstracellulære medium.Fyld pitriskålen med Xenopus Ringers opløsning indeholdende 100 mikromolar tubocurarine for at forhindre muskelsammentrækninger. Anhold skålen med tadspolen under et opretstående mikroskop. Tilslut beholderen med Xenopus Ringers opløsning med skålen ved hjælp af polyethylenrør for kontinuerlig overflod af Xenopus Ringers opløsning.Start perfusing Xenopus Ringer's løsning. Bevar opløsningens niveau i skålen konstant under hele eksperimentet. Løbende evaluere tadpole levedygtighed ved at observere blodcirkulationen gennem karrene.Begynd levende billeddannelse ved hjælp af en lav forstørrelse mål at visualisere tadpolen. Flyt mikromanipulatoraksen for at placere kapillæren, der leverer lugtopløsningen, på toppen af en næsekapsel og danner en 90 graders vinkel med olfaktoriske nerve. Find olfaktoriske pære placeret ipsilaterally til næsekapslen.Skift til en høj forstørrelse vand mål med en lang arbejdsafstand. Kontroller florescence emission af I.Glomerular strukturer bør være indlysende. Begynd med pipettering 20 milliliter frisk aminosyre opløsning i en forhøjet reservoir.Derefter tage seks fødevarer berøvet tadpoler fra deres boliger tank, og placere dem i to liter rent tadpole vand for at minimere eksponeringen for lugtstoffer. Placer en modificeret seks godt fad på en hvid LED transilluminator. Fyld hver brønd med 10 milliliter tadpole vand.Placer en pertudse pr brønd, derefter overlade til hvile i mindst tre minutter. Start billedindkøb, og hent film, der indeholder basale, stimulus- og genoprettelsesperioder. En attraktiv reaktion kan påvises som en bevægelse mod dysen levere opløsningen af aminosyrer.Returnere dyr til deres tank efter billeddannelse. Sporing tadpole hoved positioner inden for et areal på 35 millimeter med 35 millimeter, eller den tilsvarende størrelse i pixels, giver en kvantitativ analyse af olfaktoriske-guidet adfærd. Den stiplede linje repræsenterer det proksimale område til lugtopløsningen indløb.Individuelle parceller af tadpole bevægelser er konstrueret ved hjælp af X Y koordinater opnået ved billedanalyse. De udtrukne motilitet plots skal trofast gengive videobilleder. En region af interesse på 8,75 millimeter radius centreret om opløsningen indløb bruges til at klassificere nærhed af dyrene til lugtgener.Mere tid brugt i nærheden af odorantens dyse indikerer positiv tropisme. Tid brugt af tadspoler i nærheden af dysen i definerede perioder, for eksempel, 15 sekunder intervaller, giver mulighed for identifikation af evnen til at opdage aminosyre løsninger. Den samlede adfærd af en population af tadpoler kan opnås ved at plotte fordelingen af de enkelte data.Positiv tropisme kan påvises, når aminosyreopløsningen fremstilles ved en millimolar eller 160 mikromolar. Dyrene reagerer ikke på vandapplikationen. Efter denne procedure, andre metoder som histologiske teknikker eller elektrofysiologi, kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål som ændring af synaptiske egenskaber efter skade.Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for neurobiologi at udforske behandlingen af olfaktoriske oplysninger i Xenopus tadpole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associativ olfaktorisk læring i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Optagelse metoder til karakterisering af neurale aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Lugtesansen Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation af olfaktoriske Ensheathing Cells at evaluere Funktionel Recovery efter perifer nerveskade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Tilberedninger af den intakte Vomeronasal orgel og tilbehør lugtekolben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionel Evaluering af biologisk Neurotoksiner i Networked Kulturer af stamceller afledt centralnervesystemet neuroner

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforeret Patch-clamp Registrering af Mouse Olfactory sensoriske neuroner i Intakt neuroepithelium: Funktionel analyse af neuroner udtrykker en identificeret odorantreceptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Optagelse Temperatur-induceret neuronal aktivitet gennem Overvågning Calcium Ændringer i det olfaktoriske pære af<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

En objektiv og reproducerbare Test af olfaktoriske læring og diskrimination i mus

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Præparater og protokoller for hele cellen Patch klemme optagelsen af Xenopus laevis Tectal neuroner

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...