Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (EFRO), gefinancierd door concurrentieonderzoek awards van de M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, de Stephen W. Kuffeler Fellowship Fonds, Laura en Arthur Colwin begiftigd zomer Fellowship onderzoeksfonds , de Fischbach Fellowship, en het grote fonds van de generatie van de mariene biologische laboratorium en de nationale Xenopus Resource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) waar een deel van dit werk werd uitgevoerd. Wij danken ook CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning. A.L. is een fellow van de Serra Húnter.

Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dierlijke onderzoek aan Universiteit van Barcelona.
Opmerking: De kikkervisjes van X. tropicalis en X. laevis worden gefokt volgens de standaardmethoden13,14. Tadpole water wordt bereid door commerciële zouten (Zie Tabel van materialen) toe te voegen aan water verkregen door omgekeerde osmose. Geleidbaarheid wordt ...

<ol>
	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+olfactory+placode+on+the+development+of+the+brain+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Axonal+growth+and+connections+of+the+transplanted+olfactory+placode.">Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-grained+fate+maps+for+the+ophthalmic+and+maxillomandibular+trigeminal+placodes+in+the+chick+embryo.">Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo.</a> Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).</li><li>Friedrich, R. W., Korsching, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+and+chemotopic+odorant+coding+in+the+zebrafish+olfactory+bulb+visualized+by+optical+imaging.">Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging.</a> Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis.">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Koide, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neural+circuitry+for+attraction+to+amino+acids+revealed+by+transposon-mediated+gene+trap+approach+in+zebrafish.">Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).</li><li>Truszkowski, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System.">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li><li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).</li><li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Dit witboek beschrijft technieken die nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes. Het huidige protocol is vooral handig voor laboratoria die werken, of toegang hebben tot Xenopus; het is echter ook interessant voor deze onderzoekers bestuderen de cellulaire en moleculaire grondslagen van neuronale regeneratie en reparatie. Resultaten van Xenopus kunnen worden gecombineerd met gegevens die zijn verzameld in andere gewerveld...

Xenopus kikkervisjes vormen een uitstekende diermodel om te bestuderen van de normale functie van het zenuwstelsel. Transparantie, een volledig gesequenceerd genoom1,2, en de toegankelijkheid van chirurgische, elektrofysiologische en imaging technieken zijn unieke eigenschappen van Xenopus larven waarmee onderzoeken neuronale functies in vivo3 . Enkele van de meerdere experimentele mogelijkheden van deze diermodel worden geïllustreerd door de grondige studies uitgevoerd op tadpole sensorische en motorische systemen4,5,6. Een bijzonder geschikt neuronale circuit te bestuderen van vele aspecten van informatie verwerking op het niveau van synapsen is de Xenopus tadpole olfactorische systeem7. In de eerste plaats de synaptische verbinding is goed gedefinieerd: olfactorische receptor neuronen (ORNs) naar de bulbus olfactorius project en synaptische contacten leggen met dendrites van mitralisklep/getuft cellen binnen de glomeruli geur kaarten. Ten tweede, zijn ORNs worden voortdurend gegenereerd door neurogenese gedurende het hele leven te handhaven van de functionaliteit van olfactorische trajecten8. En ten derde omdat de olfactorische systeem een groot regeneratieve vermogen blijkt, Xenopus kikkervisjes kunnen hun bulbus olfactorius na ablatie9volledig te hervormen.
In deze paper beschrijven we benaderingen die beeldvorming van olfactorische glomeruli in levende kikkervisjes met gedrags experimenten combineren te bestuderen van de functionaliteit van olfactorische trajecten. De hier gedetailleerde methoden werden gebruikt om de studie van het functionele herstel van de glomerulaire connectiviteit in de bulbus olfactorius na bulbus zenuw transect10. Gegevens die zijn verkregen in Xenopus kikkervisjes representatief zijn voor gewervelden omdat olfactorische verwerking evolutionaire is bewaard.
De beschreven methoden zijn geïllustreerd met behulp van X. tropicalis , maar ze kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd in X. laevis. Ondanks de grotere omvang van de volwassen X. laeviszijn beide soorten opvallend vergelijkbaar tijdens tadpole stadia. De belangrijkste verschillen bevinden zich op het genomisch niveau. X. laevis geeft arme genetische werkwillig, meestal bepaald door haar allotetraploid genoom en de lange generatietijd (ongeveer 1 jaar). Is daarentegen meer vatbaar voor genetische modificaties vanwege de kortere generatietijd (5 tot 8 maanden) en diploïde genoom X. tropicalis . De representatieve experimenten worden geïllustreerd voor wild-type dieren en drie verschillende transgene lijnen: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) en tubb2:GFP (X. laevis).
De methoden die worden beschreven in de lopende werkzaamheden moeten naast de genetische vordert in het veld Xenopus worden beschouwd. De eenvoud en de eenvoudige implementatie van de technieken gepresenteerd maakt ze bijzonder nuttig voor de evaluatie van de reeds beschreven mutanten11, evenals Xenopus regels gegenereerd door CRISPR-Cas9 technologie12. Ook beschrijven we een chirurgische ingreep gewend transect bulbus zenuwen die kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium dat die toegang hebben tot Xenopus kikkervisjes. De benaderingen gebruikt voor de evaluatie van de reacties van de presynaptische calcium en olfactorische geleide gedrag vereisen specifieke apparatuur, zij beschikbaar op een matige kosten. Methoden worden gepresenteerd in een eenvoudig formulier ter bevordering van het gebruik ervan in de onderzoeksgroepen en de grondslagen van meer complexe tests kon instellen door het implementeren van verbeteringen of door de associatie met andere technieken, dat wil zeggen, histologische of genetische benaderingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel. Zij bieden meerdere experimentele voordelen, zoals toegankelijkheid van talrijke imaging benaderingen, elektrofysiologische technieken en gedrags testen. Het Xenopus tadpole olfactorische systeem is bijzonder goed geschikt voor onderzoeken van de functie van synapsen gevestigd tijdens normale ontwikkeling of hervormd na blessure. Hier beschrijven we methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven. We schetsen een combinatie van in vivo metingen van exocytose calcium reacties in de glomeruli van de bulbus olfactorius met olfactorische geleide gedrag testen. Methoden kunnen worden gecombineerd met het transect van bulbus zenuwen te bestuderen de bedrading van synaptic connectiviteit. Experimenten zijn gepresenteerd met behulp van zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren uiten GFP verslaggevers in cellen van het centrale zenuwstelsel. Toepassing van de methoden beschreven om genetisch gemodificeerde kikkervisjes kan nuttig zijn voor het ontrafelen van de moleculaire grondslagen die gewervelde gedrag definiëren.

In deze paper presenteren we een combinatie van twee complementaire benaderingen voor het uitvoeren van in-vivo -onderzoek van de functionaliteit van de Xenopus tadpole olfactorische systeem: ik) een methode voor imaging presynaptische Ca2 + veranderingen in de glomeruli van leven kikkervisjes met behulp van een fluorescerende calcium indicator, en ii) begeleide een geur gedrags test die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de reactie op specifieke wat...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Deze methode kan nuttig zijn om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van neurobiologie, zoals hoe presynaptische terminals in vivo functioneren. Het belangrijkste voordeel van deze reeks technieken is dat we gratis benaderingen tonen om de functie van reukpaden te gebruiken met Xenopus kikkervisjes als diermodel. Het demonstreren van deze procedure zal ik zijn, Beatrice Terni, en Paolo Pacciolla.Begin met de transsectieprocedure door twee stukken cellulose kwalitatief filterpapier in 0,02% MS2 22-verdovingsoplossing te bevochtigen en onder het ontleden toepassingsgebied te plaatsen. Kies dan een kikkervisje uit de tank en dompel het onder in een schotel van verdovingsoplossing. De kikkervis moet stoppen met zwemmen binnen twee tot vier minuten.Controleer op een goede verdovendering door de afwezigheid van een reactie op mechanische stimuli toegepast op het staartniveau met behulp van pincet. Plaats de verdoofde kikkervis op het filterpapier onder het toepassingsgebied. Plaats het dier met zijn rugzijde naar boven gericht, zodat hersenstructuren kunnen worden gevisualiseerd.Voor gedragsmatige experimenten, gebruik veni schaar om beide zenuwen transect om alle geurige informatie die aan de reukbol te onderdrukken. Laad een poled glas pipet met twee microliters van calciumgroen een dextrine oplossing, en plaats het in de microinjector. Plaats een verdoofde kikkervis onder de ontledenmicroscoop op filterpapier, verplaats vervolgens de punt van de pipet in de belangrijkste holte van de neuscapsule en lever 0,15 tot 0,3 microliter van de kleurstof.Laat de kikkervis twee tot drie minuten op zijn plaats. Druppel met behulp van een Pasteur pipet 0,02%MS2 22-oplossing op de meer vertroddlee delen van het dier om te voorkomen dat het wordt gedroogd. Breng het dier naar de hersteltank waar de kikkervis binnen 10 minuten of zo normaal moet zwemmen.Observeer de florescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de reukbol op de dag na de injectie. Bereid een verdoofde kikkervis voor beeldvorming door eerst het verwijderen van de huid boven de reukbol. Gebruik veni schaar om een laterale incisie te maken op de huid van de kikkervis aan de rand van het centrale zenuwstelsel op het niveau van de reukbol.Vermijd het uitbreiden van de snede naar het tectum, die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door de locatie van de oogzenuw. Houd het dier vochtig door het toepassen van druppels van 0,02%MS2 22 oplossing met behulp van een Pasteur pipet dan knijp de gesneden huid met behulp van een pincet en trek het over het zenuwstelsel. Controleer succesvolle verwijdering door de afwezigheid van melanocyten boven de reukbol.Plaats de kikkervis in de put van de cel bewaker gecoate schotel. Plaats een glazen deksel met een hoog vacuümvet om de bovenkant van het tectum tot het einde van de staart te bedekken. Zorg ervoor dat de olfactorische bol en placodes blijven blootgesteld aan het extracellulaire medium.Vul de pitri schotel met Xenopus Ringer's oplossing met 100 micromolar tubocurarine om spiercontracties te voorkomen. Plaats de schotel met de kikkervis onder een rechtopstaande microscoop. Sluit het reservoir met de oplossing van Xenopus Ringer aan op de schotel met behulp van polyethyleenbuizen voor continue overvloed aan de oplossing van Xenopus Ringer.Begin met het doorsluipen van de oplossing van Xenopus Ringer. Houd het niveau van de oplossing in de schotel constant gedurende het hele experiment. Voortdurend evalueren kikkervisje levensvatbaarheid door het observeren van de bloedcirculatie door de bloedvaten.Begin live beeldvorming met behulp van een lage vergroting doelstelling om de kikkervis te visualiseren. Verplaats de micromanipulator as om de capillaire leveren van de geurige oplossing op de top van een neuscapsule, de vorming van een 90 graden hoek met de reukzenuw. Vind de reuklamp ipsilateraal in de neuscapsule.Schakel over naar een hoogvergrotingwaterdoelstelling met een lange werkafstand. Controleer de florescentie emissie door I.Glomerular structuren moet duidelijk zijn. Begin met het pipetten van 20 milliliter verse aminozuuroplossing in een verhoogd reservoir.Neem dan zes voedsel beroofd kikkervisjes uit hun behuizing tank, en plaats ze in twee liter schoon kikkervisje water om de blootstelling aan geurstoffen te minimaliseren. Plaats een aangepaste zes put schotel op een witte LED transilluminator. Vul elk goed met 10 milliliter kikkerviswater.Plaats een kikkervis per goed, laat dan rusten voor ten minste drie minuten. Start beeldverwerving en verwerf films die basale, stimulus- en herstelperioden bevatten. Een aantrekkelijke respons kan worden gedetecteerd als een beweging naar het mondstuk leveren van de oplossing van aminozuren.Breng dieren terug naar hun tank na beeldvorming. Het bijhouden van kikkervishoofdposities binnen een gebied van 35 millimeter bij 35 millimeter, of de gelijkwaardige grootte in pixels, maakt een kwantitatieve analyse van reukgeleid gedrag mogelijk. De stippellijn vertegenwoordigt het proximale gebied aan de geuroplossinginlaat.Individuele percelen kikkervisbewegingen worden geconstrueerd met behulp van X Y-coördinaten verkregen door beeldanalyse. De geëxtraheerde beweeglijkheidspercelen moeten getrouw videobeelden reproduceren. Een gebied van belang van 8.75 millimeterstraal gecentreerd op de oplossingsinlaat wordt gebruikt om de nabijheid van de dieren aan de geurige bron te classificeren.Meer tijd doorgebracht in de buurt van het mondstuk van de geurstof duidt op positief tropisme. Tijd doorgebracht door kikkervisjes in de buurt van het mondstuk tijdens bepaalde periodes, bijvoorbeeld, 15 seconden intervallen, maakt het mogelijk identificatie van de mogelijkheid om aminozuur oplossingen te detecteren. Het algemene gedrag van een populatie kikkervisjes kan worden verkregen door de verdeling van individuele gegevens in kaart te brengen.Positief tropisme kan worden gedetecteerd wanneer de aminozuuroplossing wordt bereid bij een millimolar of 160 micromolar. Dieren reageren niet op watertoepassingen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologische technieken of elektrofysiologie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijziging van synaptische eigenschappen na letsel.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neurobiologie om de verwerking van reukinformatie in Xenopus-kikkervis te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Bereidingen van de Intact Vomeronasal en accessoires bulbus olfactorius

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Een objectieve en reproduceerbare Test van olfactorische leren en discriminatie in muizen

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...