Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung. A.L. ist Serra Húnter Fellow.

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Tierforschung an Universität von Barcelona genehmigt.
Hinweis: X. tropicalis und laevis Kaulquappen werden nach Standardmethoden13,14aufgezogen. Kaulquappe Wasser wird vorbereitet, indem man kommerzielle Salze (siehe Tabelle der Materialien) zu Wasser durch Umkehrosmose gewonnen. Leitfähigkeit wird ∼700 µS und ∼1, 400 µS für <...

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	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. 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Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System.">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li><li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).</li><li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte ...

Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5,6dargestellt. Eine besonders gut geeignet neuronale Schaltung, viele Aspekte der Informationsverarbeitung auf der Ebene der Synapsen ist Xenopus Kaulquappe olfaktorischen System7. Erstens die synaptische Konnektivität ist klar definiert: olfaktorische Rezeptor Neuronen (ORNs) Projekt auf den Riechkolben und synaptischen Kontakte mit Dendriten Mitral-/getuftet Zellen innerhalb von Glomeruli Geruch Karten zu generieren. Zweitens entstehen seine ORNs kontinuierlich durch Neurogenese während des gesamten Lebens die Funktionalität von olfaktorische Bahnen8zu erhalten. Und drittens, weil des olfaktorischen Systems eine große regenerative Fähigkeit zeigt, Xenopus Kaulquappen können ihre Riechkolben ganz nach Ablation9zu reformieren.
In diesem Artikel beschreiben wir Ansätze, die Darstellung der olfaktorischen Glomeruli in lebenden Kaulquappen mit Verhaltensexperimente, die Funktionalität der olfaktorische Bahnen zu studieren. Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um die funktionelle Wiederherstellung der glomerulären Konnektivität in den Riechkolben nach Riechnerv Durchtrennung10zu studieren. In Xenopus Kaulquappen gewonnenen Daten sind Vertreter der Wirbeltiere, da olfaktorische Verarbeitung evolutionär ist konserviert.
Die beschriebenen Methoden sind beispielhaft dargestellt, mit X. tropicalis , aber sie können leicht in Xumgesetzt werden. Laevis. Trotz der größeren Größe des Erwachsenen laevissind beide Arten in Kaulquappe Phasen bemerkenswert ähnlich. Die Hauptunterschiede liegen auf Genomebene. Laevis zeigt schlechte genetische Lenkbarkeit, vor allem durch seine Allotetraploid Genom und lange Generationszeit (ca. 1 Jahr) bestimmt. X. Tropicalis ist dagegen besser geeignet, um genetische Veränderungen aufgrund der kürzeren Generationszeit (5 – 8 Monate) und diploiden Genom. Die repräsentative Experimente sind für Wildtyp Tiere und drei verschiedenen transgenen Linien dargestellt: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) und Tubb2:GFP (laevis).
Die in die aktuelle Arbeit beschriebenen Methoden sollte neben der genetischen fortschreitet im Feld Xenopus betrachtet werden. Die Einfachheit und die einfache Umsetzung der vorgestellten Techniken macht sie besonders nützlich für die Bewertung der bereits beschriebenen Mutanten11sowie Xenopus Linien von CRISPR-Cas9 Technologie12generiert. Wir beschreiben auch einen chirurgischen Eingriff zur Geruchsnerven Transekt, die in jedem Labor Zugang zu Xenopus Kaulquappen umgesetzt werden können. Die Ansätze für die Bewertung der präsynaptischen Kalzium Antworten verwendet und olfaktorischen geführte Verhalten erfordern spezielle Ausrüstung, wenn auch auf einem moderaten Kosten zur Verfügung. Methoden sind in einer einfachen Form zur Förderung ihrer Verwendung in Forschungsgruppen vorgestellt und konnte die Grundlagen von komplexeren Assays festgelegt, durch die Implementierung von Verbesserungen oder durch den Verein zu anderen Techniken, d.h., histologische oder genetische Ansätze.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
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functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.

In diesem Beitrag präsentieren wir eine Kombination aus zwei komplementäre Ansätze in Vivo Studie über die Funktionalität des Xenopus Kaulquappe olfaktorischen Systems ausführen: ich) ein Verfahren zur Bildgebung präsynaptischen Ca2 + ändert in den Glomeruli des Lebens Kaulquappen mit einem fluoreszierenden Kalzium Indikator und Ii) geführte ein Geruch Verhaltens Assay, die verwendet werden, um die Reaktion auf bestimmte wasserbasierte Geruchsstoffe z...

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Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Diese Methode kann nützlich sein, um wichtige Fragen in neurobiologischen Bereichen zu beantworten, wie z. B. wie präsynaptische Terminals in vivo funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass wir kostenlose Ansätze zeigen, um die Funktion von Geruchswegen mit Xenopus Kaulquappen als Tiermodell zu beanstanden. Diese Prozedur werde ich, Beatrice Terni und Paolo Pacciolla, demonstrieren.Beginnen Sie das Transektionsverfahren, indem Sie zwei Stücke von cellulosequalitativem Filterpapier in 0,02%MS2 22 Anästhesielösung benetzen und unter den Sezierbereich stellen. Dann eine Kaulquappe aus dem Tank holen und in eine Schale mit Anästhesieein eintauchen. Die Kaulquappe sollte innerhalb von zwei bis vier Minuten aufhören zu schwimmen.Überprüfen Sie die richtige Betäubung durch das Fehlen einer Reaktion auf mechanische Reize, die auf der Schwanzebene mit einer Pinzette angewendet werden. Legen Sie die anästhesierte Kaulquappe auf das Filterpapier unter den Rahmen. Positionieren Sie das Tier mit seiner Rückenseite nach oben, damit Hirnstrukturen visualisiert werden können.Für Verhaltensexperimente verwenden Sie Veni-Schere, um beide Nerven zu transsektieren, um alle Geruchsinformationen zu unterdrücken, die in die Riechbirne gelangen. Eine Polglaspipette mit zwei Mikrolitern Calciumgrün eine Dextrine Lösung einundsanlegen und in den Mikroinjektor legen. Legen Sie einen anästhesierten Kaulauf unter das Sezieren des Mikroskops auf Filterpapier, bewegen Sie dann die Spitze der Pipette in die Haupthöhle der Nasenkapsel und liefern Sie 0,15 bis 0,3 Mikroliter des Farbstoffs.Lassen Sie die Kaulquappe für zwei bis drei Minuten an Ort und Stelle. Mit einer Pasteur-Pipette, tropfen 0,02%MS2 22 Lösung auf die mehr Kabeljau Teile des Tieres, um das Trocknen zu vermeiden. Übertragen Sie das Tier in den Bergungstank, wo die Kaulquappe das normale Schwimmen innerhalb von 10 Minuten oder so wiederherstellen sollte.Beobachten Sie die Blütenstand auf der Ebene der glomerulären Schicht der Olfaktorbirne am Tag nach der Injektion. Bereiten Sie eine anästhesierte Kaulquappe für die Bildgebung vor, indem Sie zuerst die Haut über der Olfaktor-Lampe entfernen. Verwenden Sie Veni-Schere, um einen seitlichen Schnitt auf der Haut der Kaulquappe am Rand des zentralen Nervensystems auf der Ebene der Olfaktor-Lampe zu machen.Vermeiden Sie es, den Schnitt auf das Tectum auszudehnen, das leicht an der Position des Sehnervs identifiziert werden kann. Halten Sie das Tier feucht, indem Sie Tropfen von 0.02%MS2 22 Lösung mit einer Pasteur Pipette dann kneifen Sie die geschnittene Haut mit einer Pinzette und ziehen Sie es über das Nervensystem. Überprüfen Sie die erfolgreiche Entfernung durch das Fehlen von Melanozyten über der Olfaktor-Glühbirne.Legen Sie die Kaulquappe in den Brunnen der zellschutzbeschichteten Schale. Positionieren Sie einen mit Hochvakuumfett beschichteten Glasdeckel, um die Oberseite des Tectums bis zum Ende des Schwanzes zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Olfaktor-Lampe und die Placodes dem extrazellulären Medium ausgesetzt bleiben.Füllen Sie die Pitrischale mit xenopus Ringers Lösung, die 100 Mikromolar-Tubocurarine enthält, um Muskelkontraktionen zu verhindern. Legen Sie die Schale, die die Kaulquappe unter einem aufrechten Mikroskop hält. Verbinden Sie das Reservoir, das die Lösung von Xenopus Ringer enthält, mit der Schale mit Polyethylenschläuchen, um die Lösung von Xenopus Ringer kontinuierlich zu überpromitben.Beginnen Sie mit der Lösung von Xenopus Ringer. Halten Sie das Niveau der Lösung in der Schale konstant während des gesamten Experiments. Kontinuierliche Bewertung der Kaulquappenlebensfähigkeit durch Beobachtung der Durchblutung durch die Gefäße.Beginnen Sie die Live-Bildgebung mit einem Ziel mit geringer Vergrößerung, um die Kaulquappe zu visualisieren. Bewegen Sie die Mikromanipulatorachse, um die Kapillare, die die Geruchslösung liefert, auf der Oberseite einer Nasenkapsel zu platzieren, wodurch ein 90-Grad-Winkel mit dem Riechnerv entsteht. Finden Sie die Olfaktor-Lampe ipsilaterally an der Nasenkapsel.Wechseln Sie zu einem Hochvergrößerungswasserobjektiv mit einem langen Arbeitsabstand. Überprüfen Sie die Blütenstandemission von I.Glomerular Strukturen sollte offensichtlich sein. Beginnen Sie mit der Pipettierung von 20 Millilitern frischer Aminosäurelösung in ein erhöhtes Reservoir.Dann nehmen Sie sechs Lebensmittel beraubt Kaulquappen aus ihrem Gehäusetank, und legen Sie sie in zwei Liter saubere kauquappen Wasser, um die Exposition gegenüber Geruchsstoffen zu minimieren. Legen Sie eine modifizierte sechs Brunnenschale auf einen weißen LED-Transilluminator. Füllen Sie jeden Brunnen mit 10 Milliliter Kaulquappenwasser.Legen Sie eine Kaulquappe pro Brunnen, dann lassen Sie für mindestens drei Minuten ruhen. Starten Sie die Bildaufnahme und erfassen Sie Filme, die Basal-, Stimulus- und Erholungsphasen enthalten. Eine attraktive Reaktion kann als Bewegung in Richtung der Düse erkannt werden, die die Lösung von Aminosäuren liefert.Bringen Sie die Tiere nach der Bildgebung in ihren Tank zurück. Die Verfolgung von Kaulquappenkopfpositionen innerhalb einer Fläche von 35 Millimetern x 35 Millimetern oder der entsprechenden Größe in Pixeln ermöglicht eine quantitative Analyse des geruchsgeführten Verhaltens. Die gepunktete Linie stellt den proximalen Bereich zum Geruchslösungseinlass dar.Einzelne Plots von Kaulquappenbewegungen werden mit X-Y-Koordinaten erstellt, die durch Bildanalyse erhalten werden. Die extrahierten Motilitätsdiagramme müssen Videobilder originalgetreu wiedergeben. Ein Bereich von Interesse von 8,75 Millimeter Radius zentriert auf den Lösungseinlass wird verwendet, um die Nähe der Tiere zur Geruchsquelle zu klassifizieren.Mehr Zeit in der Nähe der Düstdüse des Geruchs deutet auf einen positiven Tropismus hin. Die Zeit, die Von Kaulquappen in der Nähe der Düse während definierter Zeiträume verbracht wird, z. B. 15 Sekunden intervallig, ermöglicht die Identifizierung der Fähigkeit, Aminosäurelösungen zu erkennen. Das Gesamtverhalten einer Population von Kaulquappen kann durch die Darstellung der Verteilung einzelner Daten ermittelt werden.Positiver Tropismus kann nachgewiesen werden, wenn die Aminosäurelösung mit einem Millimolar oder 160 Mikromolar hergestellt wird. Tiere reagieren nicht auf Wasseranwendung. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie histologische Techniken oder Elektrophysiologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Veränderung der synaptischen Eigenschaften nach Verletzungen zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiologie, um die Verarbeitung von olfaktorischen Informationen in Xenopus Kaulquappen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Eine objektive und reproduzierbare Test der olfaktorischen Lern- und Diskriminierung bei Mäusen

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...