Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), di premi di ricerca competitivo dalla M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura e Arthur Colwin dotato estate Research Fellowship Fund , la compagnia di Fischbach e il grande fondo di generazione il Marine Biological Laboratory e la nazionale RRID:SCR_013731 di risorsa di Xenopus (Woods Hole, MA) dove una parte di questo lavoro è stato condotto. Ringraziamo anche il programma CERCA / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale. A.L. è un collega di Serra Húnter.

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca animale all'Università di Barcellona.
Nota: X. tropicalis e X. laevis girini sono allevati secondo metodi standard13,14. Acqua di girino è preparato aggiungendo sali commerciali (Vedi Tabella materiali) all'acqua da osmosi inversa. Conducibilità è regolato in µS ∼700 e ∼1, 400 µS per girini X. tropical...

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	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. 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Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System.">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li><li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).</li><li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Questo documento vengono descritte le tecniche che sono utili per analizzare la funzionalità delle vie olfattive in vita girini di Xenopus . Il protocollo attuale è particolarmente utile per i laboratori che lavorano, o hanno accesso a Xenopus; Tuttavia, è anche interessante per quei ricercatori che studiano le basi cellulari e molecolari di riparazione e rigenerazione neuronale. Risultati ottenuti in Xenopus possono essere combinati con dati raccolti in altri modelli vertebrati per identifi...

Girini di Xenopus costituiscono un eccellente modello animale per studiare la funzione normale del sistema nervoso. Trasparenza, un genoma sequenziato completamente1,2e accessibilità alle tecniche chirurgiche, elettrofisiologiche e imaging sono proprietà uniche delle larve di Xenopus che consentono di indagare funzioni neuronali in vivo3 . Alcune delle possibilità più sperimentale di questo modello animale sono illustrate da studi approfonditi su girino sistemi sensoriali e motori4,5,6. Un circuito neuronale particolarmente adatto per studiare molti aspetti di elaborazione a livello delle sinapsi delle informazioni è il sistema olfattivo girino di Xenopus 7. In primo luogo, la sua connettività sinaptica è ben definita: neuroni olfattivi (ORNs) del progetto al bulbo olfattivo e stabilire contatti sinaptici con dendriti delle cellule mitrali/trapuntato all'interno dei glomeruli per generare mappe di odore. In secondo luogo, sua ORNs vengono continuamente generati da neurogenesi per tutta la vita per mantenere la funzionalità delle vie olfattive8. E in terzo luogo, perché il sistema olfattivo Mostra una grande capacità rigenerativa, girini di Xenopus sono in grado di riformare completamente il loro bulbo olfattivo dopo ablazione9.
In questo articolo, descriviamo gli approcci che combinano formazione immagine dei glomeruli olfattivi in girini vivente con esperimenti comportamentali per studiare la funzionalità delle vie olfattive. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare il recupero funzionale di connettività glomerulare nel bulbo olfattivo dopo nervo olfattivo transection10. I dati ottenuti in girini di Xenopus sono rappresentativi dei vertebrati poiché l'elaborazione olfattiva evolutivo conservato.
I metodi descritti sono esemplificati utilizzando X. tropicalis ma può essere facilmente implementati in X. laevis. Nonostante le dimensioni dell'adulto X. laevis, entrambe le specie sono notevolmente simili durante le fasi di girino. Le principali differenze risiedono a livello genomico. X. laevis Visualizza scarsa trattabilità genetico, determinato prevalentemente dalla sua allotetraploide genoma e tempo di lunga generazione (circa 1 anno). Al contrario, x. tropicalis è più suscettibili di modificazioni genetiche, grazie alla sua più breve tempo di generazione (5 – 8 mesi) e il genoma diploide. Gli esperimenti rappresentativi sono illustrati per animali di selvaggio-tipo e tre diverse linee transgeniche: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).
Le metodologie descritte nel lavoro attuale dovrebbero essere considerate a fianco la genetica progredisce nel campo di Xenopus . La semplicità e la facile implementazione di tecniche presentate li rende particolarmente utili per la valutazione già descritto mutanti11, nonché linee di Xenopus generati da CRISPR-Cas9 tecnologia12. Inoltre descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per transetto nervi olfattivi che può essere implementati in qualsiasi laboratorio avendo accesso a girini di Xenopus . Gli approcci utilizzati per la valutazione delle risposte del calcio presinaptico e olfattivo-Guida di comportamento richiedono attrezzature specifiche, seppur disponibile ad un costo moderato. Metodologie sono presentati in una forma semplice per promuovere il loro uso in gruppi di ricerca e potrebbero porre le basi di analisi più complesse sia implementando miglioramenti o l'associazione ad altre tecniche, ossia approcci di genetica o istologici, .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso. Essi forniscono molteplici vantaggi sperimentali, quali l'accessibilità a numerosi approcci di imaging, tecniche elettrofisiologiche e comportamentali saggi. Il sistema olfattivo di Xenopus girino è particolarmente adatto per studiare la funzione delle sinapsi stabilito durante lo sviluppo normale o riformato dopo la ferita. Qui, descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione delle informazioni olfattive nella vita di larve di Xenopus . Descriviamo una combinazione di misurazioni in vivo delle risposte del calcio presinaptico in glomeruli del bulbo olfattivo con dosaggi comportamento olfattivo-guida. Metodi possono essere combinati con il transection dei nervi olfattivi per studiare il riavvolgimento delle connessioni sinaptiche. Gli esperimenti sono presentati utilizzando animali wild-type e geneticamente modificati che esprimono i reporter GFP in cellule del sistema nervoso centrale. Applicazione degli approcci descritti a girini geneticamente modificati può essere utile per svelare le basi molecolari che definiscono il comportamento dei vertebrati.

In questa carta, presentiamo una combinazione di due approcci complementari per eseguire in vivo studio della funzionalità del sistema olfattivo girino Xenopus : ho) un metodo per l'imaging presinaptici Ca2 + cambia nei glomeruli dei viventi girini utilizzando un indicatore fluorescente del calcio e ii) un odore guidata analisi comportamentale che può essere utilizzato per studiare la risposta a specifici odoranti a base acquosa. Dal momento che questi appro...

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Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Questo metodo può essere utile per rispondere a domande chiave in campi di neurobiologia come come funzionano i terminali presnaptici in vivo. Il vantaggio principale di questo insieme di tecniche è che mostriamo approcci gratuiti per valutare la funzione delle vie olfattive usando girini Xenopus come modello animale. A dimostrare questa procedura saranno io, Beatrice Terni, e Paolo Pacciolla.Iniziare la procedura di trasezione bagnando due pezzi di carta filtrante qualitativa di cellulosa in soluzione anestetica 0,02%MS2 22 e posizionandoli nell'ambito di sezionatura. Quindi scegli un girino dal serbatoio e immergelo in un piatto di soluzione anestetica. Il girino dovrebbe smettere di nuotare entro due o quattro minuti.Verificare la corretta anestetizzazione per assenza di una reazione agli stimoli meccanici applicati a livello della coda utilizzando una pinzetta. Posizionare il girino anestetizzato sulla carta filtrante sotto l'ambito. Posizionare l'animale con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che le strutture cerebrali possano essere visualizzate.Per esperimenti comportamentali, usa le forbici veni per traslimare entrambi i nervi per sopprimere tutte le informazioni odoranti che arrivano al bulbo olfattivo. Caricare una pipetta di vetro poled con due microlitri di soluzione di destrorina verde calcio e posizionarla nel microiniettore. Posizionare un girino anestetizzato sotto il microscopio sezionato su carta da filtro, quindi spostare la punta della pipetta nella cavità principale della capsula nasale e fornire da 0,15 a 0,3 microlitri del colorante.Lasciare il girino in posizione per due o tre minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, gocciolare la soluzione 0,02%MS2 22 sulle parti più coddle dell'animale per evitare l'essiccazione. Trasferire l'animale nel serbatoio di recupero in cui il girino dovrebbe recuperare il normale nuoto entro circa 10 minuti.Osservare la florescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo il giorno dopo l'iniezione. Preparare un girino anestetizzato per l'imaging rimuovendo prima la pelle sopra il bulbo olfattivo. Utilizzare le forbici veni per fare un'incisione laterale sulla pelle del girino sul bordo del sistema nervoso centrale a livello del bulbo olfattivo.Evitare di estendere il taglio allo tectum, che può essere facilmente identificato dalla posizione del nervo ottico. Mantenere l'animale umido applicando gocce di soluzione 0,02%MS2 22 utilizzando una pipetta Pasteur, quindi pizzicare la pelle tagliata usando una pinzetta e tirarla sul sistema nervoso. Verificare la corretta rimozione per assenza di melanociti sopra il bulbo olfattivo.Posizionare il girino nel pozzo del piatto rivestito di guardia cellulare. Posizionare uno scivolo di copertura in vetro rivestito con grasso sottovuoto elevato per coprire la parte superiore dello tectum fino all'estremità della coda. Assicurarsi che la lampadina olfattiva e i placodici rimangano esposti al mezzo extracellulare.Riempire il piatto pitri con la soluzione di Xenopus Ringer contenente 100 tubocurarine micromolare per prevenire contrazioni muscolari. Posizionare il piatto tenendo il girino al microscopio verticale. Collegare il serbatoio contenente la soluzione di Xenopus Ringer con il piatto utilizzando tubi in polietilene per una profusione continua della soluzione di Xenopus Ringer.Inizia a perfondere la soluzione di Xenopus Ringer. Mantenere costante il livello della soluzione nel piatto durante l'esperimento. Valutare continuamente la vitalità del girino osservando la circolazione sanguigna attraverso i vasi.Inizia l'imaging dal vivo usando un obiettivo a basso ingrandimento per visualizzare il girino. Spostare l'asse del micromanipolatore per posizionare il capillare fornendo la soluzione di odorante sulla parte superiore di una capsula nasale, formando un angolo di 90 gradi con il nervo olfattivo. Trova il bulbo olfattivo situato ipsilateralmente nella capsula nasale.Passa a un obiettivo di acqua ad alto ingrandimento con una lunga distanza di lavoro. Controllare l'emissione di florescence da parte delle strutture I.Glomerular dovrebbe essere ovvio. Iniziare con pipettando 20 millilitri di soluzione di amminoacidi freschi in un serbatoio elevato.Quindi prendi sei girini privi di cibo dal loro serbatoio di alloggio e posizionali in due litri di acqua pulita del girino per ridurre al minimo l'esposizione agli odori. Posizionare un piatto da sei po' modificato su un transilluminatore a LED bianco. Riempire ogni bene con 10 millilitri di acqua girino.Posizionare un girino per pozzo, quindi lasciare riposare per almeno tre minuti. Avvia l'acquisizione di immagini e acquisisci filmati che contengono periodi basali, stimolanti e di recupero. Una risposta attraente può essere rilevata come un movimento verso l'ugello fornendo la soluzione di amminoacidi.Riportare gli animali nel loro serbatoio dopo l'imaging. Tracciare le posizioni della testa del girino all'interno di un'area di 35 millimetri per 35 millimetri, o la dimensione equivalente in pixel, consente un'analisi quantitativa del comportamento guidato da olfattive. La linea tratteggiata rappresenta l'area prossimale all'ingresso della soluzione di odore.I singoli appezzamenti di movimenti del girino sono costruiti utilizzando le coordinate X Y ottenute dall'analisi delle immagini. Le trame di motilità estratte devono riprodurre fedelmente le immagini video. Una regione di interesse di 8,75 millimetri di raggio centrata sull'ingresso della soluzione viene utilizzata per classificare la vicinanza degli animali alla fonte di odoro.Più tempo trascorso nelle vicinanze dell'ugello dell'odoro indica tropismo positivo. Il tempo trascorso dai girini vicino all'ugello durante periodi definiti, ad esempio intervalli di 15 secondi, consente l'identificazione della capacità di rilevare soluzioni di amminoacidi. Il comportamento complessivo di una popolazione di girini può essere ottenuto tracciando la distribuzione dei singoli dati.Il tropismo positivo può essere rilevato quando la soluzione di amminoacidi viene preparata a un millimolare o 160 micromolare. Gli animali non rispondono all'applicazione dell'acqua. Seguendo questa procedura, altri metodi come le tecniche istologiche o l'elettrofisiologia, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come l'alterazione delle proprietà sinaptiche dopo la lesione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare l'elaborazione delle informazioni olfattive nel girino di Xenopus.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Ricerca

Neuroscienze

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

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