Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado por concessões do El Ministerio de Economía y competitividade (MINECO; SAF2015-63568-R) co-financiadas pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), pelo prêmio de pesquisa competitiva do M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, o Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, fundo Laura e Arthur Colwin dotado verão Research Fellowship , a bolsa de Fischbach e o grande fundo de geração do laboratório biológico marinho e o nacional Xenopus recurso RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) onde uma parte deste trabalho foi realizada. Agradecemos também o programa CERCA / Generalitat de Catalunya para apoio institucional. A.L. é um companheiro de Serra Húnter.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa animal na Universidade de Barcelona.
Nota: Girinos de X. tropicalis e X. laevis são criados de acordo com os métodos padrão13,14. Água de girino é preparada pela adição de sais comerciais (ver Tabela de materiais) para água obtida por osmose reversa. Condutividade é ajustada para ∼700 µS e ∼1, 400 ...

<ol>
	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. 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Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Este artigo descreve técnicas que são úteis para investigar a funcionalidade das vias olfativas vivos Xenopus girinos. O protocolo atual é particularmente útil para os laboratórios que trabalham, ou tem acesso a Xenopus; no entanto, também é interessante para aqueles pesquisadores estudando as bases celulares e moleculares de reparação e regeneração neuronal. Resultados obtidos em Xenopus podem ser combinados com dados coletados em outros vertebrados modelos para identificar mecanis...

Xenopus girinos constituem um excelente modelo animal para estudar a função normal do sistema nervoso. Transparência, um genoma completamente sequenciado1,2e acessibilidade às técnicas cirúrgicas, eletrofisiológicas e de imagem são propriedades exclusivas de Xenopus larvas que permitem investigar funções neuronais in vivo3 . Algumas das várias possibilidades experimentais deste modelo animal são ilustradas pelos estudos aprofundados realizados em girino sistemas sensorial e motor4,5,6. Um circuito neuronal particularmente bem adaptado para estudar muitos aspectos do processamento no nível das sinapses de informações é o girino de Xenopus sistema olfativo7. Em primeiro lugar, sua conectividade sináptica é bem definida: neurônios olfactory do receptor (ORNs) projeto para o bulbo olfactório e estabelecer contatos sinápticos com dendritos de células mitral/adornou dentro glomérulos para gerar mapas de odor. Em segundo lugar, suas ORNs são continuamente gerados pelo neurogênese durante toda a vida para manter a funcionalidade dos caminhos olfativos8. E em terceiro lugar, porque o sistema olfativo mostra uma grande capacidade regenerativa, os girinos Xenopus são capazes de reformar inteiramente seu bulbo olfatório após ablação9.
Neste trabalho, descrevemos a abordagens que combinam imagens de glomérulos olfativos em girinos vivos com experimentos comportamentais para estudar a funcionalidade das vias olfativas. Os métodos detalhados aqui foram usados para estudar a recuperação funcional de conectividade glomerular no bulbo olfatório depois de transecção do nervo olfatório10. Dados obtidos em girinos Xenopus são representativos dos vertebrados desde processamento olfativo é evolutivo conservada.
Os métodos descritos são exemplificados usando X. tropicalis , mas eles podem ser facilmente implementados em X. laevis. Apesar do maior tamanho de adulto X. laevis, ambas as espécies são notavelmente semelhantes durante a fase de girino. As principais diferenças residem no nível do genoma. X. laevis exibe pobre rastreabilidade genética, determinada principalmente pelo seu genoma allotetraploid e tempo de geração longo (aproximadamente 1 ano). Em contraste, x. tropicalis é mais passível de modificações genéticas, devido ao seu menor tempo de geração (5-8 meses) e o genoma diploide. Os experimentos representativos são ilustrados por animais selvagem-tipo e três diferentes linhas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).
As metodologias descritas no trabalho atual devem ser consideradas juntamente com a genética avança no campo Xenopus . A simplicidade e a fácil implementação das técnicas apresentadas torna particularmente útil para avaliar mutantes já descrito11, bem como linhas de Xenopus geradas pelo CRISPR-Cas9 tecnologia12. Também descrevemos um procedimento cirúrgico utilizado para transecto nervos olfativos que podem ser implementados em qualquer laboratório tendo acesso para girinos de Xenopus . As abordagens utilizadas para avaliar as respostas de cálcio pré-sináptica e comportamento olfativo guiadas exigem equipamentos específicos, embora disponível a um custo moderado. Metodologias são apresentadas em uma forma simples de promover seu uso em grupos de pesquisa e poderiam definir as bases dos ensaios mais complexos implementando melhorias ou pela associação a outras técnicas, ou seja,, abordagens histológicas ou genéticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso. Eles oferecem várias vantagens experimentais, tais como a acessibilidade para inúmeras abordagens de imagem, técnicas eletrofisiológicas e ensaios comportamentais. O sistema olfativo do girino de Xenopus é particularmente adequado para investigar a função das sinapses estabelecido durante o desenvolvimento normal ou reformado após lesão. Aqui, descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas. Nós esboçamos uma combinação de medições in vivo de respostas de cálcio pré-sináptica em glomérulos do bulbo olfatório com ensaios de comportamento olfativo-interativa. Métodos podem ser combinados com a transecção dos nervos olfativos para estudar a religação de conectividade sináptica. Experimentos são apresentados usando animais selvagem-tipo e geneticamente modificados, expressando GFP aos jornalistas em células do sistema nervoso central. Aplicação das abordagens descritas para girinos geneticamente modificados pode ser útil para desvendar as bases moleculares que definem o comportamento de vertebrados.

Neste trabalho, apresentamos uma combinação das duas abordagens complementares para executar na vivo estudo da funcionalidade do sistema olfativo Xenopus girino: eu) um método de imagem pré-sináptica Ca2 + altera em glomérulos de viver girinos usando um indicador fluorescente de cálcio e ii) um odor guiada ensaio comportamental que pode ser usado para investigar a resposta ao específico odorantes transmitidas pela água. Desde que estas abordagens têm...

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Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Este método pode ser útil para responder a perguntas-chave em campos de neurobiologia, como como funcionam os terminais pré-sinápticos in vivo. A principal vantagem desse conjunto de técnicas é que mostramos abordagens complementares para atar a função de caminhos olfativos usando girinos xenopus como modelo animal. Demonstrando este procedimento seremos eu, Beatrice Terni, e Paolo Pacciolla.Inicie o procedimento de transeção, molhando duas peças de papel filtro qualitativo de celulose em solução anestésico 0,02%MS2 22, e colocando-as sob o escopo de dissecação. Em seguida, escolha um girino do tanque e mergulhe-o em um prato de solução anestéstica. O girino deve parar de nadar dentro de dois a quatro minutos.Verifique se há anestesia adequada pela ausência de uma reação a estímulos mecânicos aplicados no nível da cauda usando pinças. Coloque o girino anestesiado no papel do filtro sob o escopo. Posicione o animal com seu lado dorsal voltado para cima para que as estruturas cerebrais possam ser visualizadas.Para experimentos comportamentais, use tesoura veni para transectar ambos os nervos para suprimir todas as informações odórantes que chegam à lâmpada olfativa. Carregue uma pipeta de vidro poled com dois microliters de solução de dextrina verde cálcio, e coloque-a no microinjetor. Coloque um girino anestesiado sob o microscópio dissecando no papel filtro, em seguida, mova a ponta da pipeta para a cavidade principal da cápsula nasal e entregue 0,15 a 0,3 microlitros do corante.Deixe o girino no lugar por dois a três minutos. Usando uma pipeta Pasteur, gotejamento 0,02%MS2 22 solução para as partes mais aconchegantes do animal para evitar a secagem. Transfira o animal para o tanque de recuperação onde o girino deve recuperar a natação normal dentro de 10 minutos ou mais.Observe florescence ao nível da camada glomerular da lâmpada olfativa no dia seguinte à injeção. Prepare um girino anestesiado para imagens removendo a pele acima da lâmpada olfativa. Use uma tesoura veni para fazer uma incisão lateral na pele do girino na borda do sistema nervoso central ao nível da lâmpada olfativa.Evite estender o corte ao tectum, que pode ser facilmente identificado pela localização do nervo óptico. Mantenha o animal úmido aplicando gotas de solução 0,02%MS2 22 usando uma pipeta Pasteur e, em seguida, belisque a pele cortada usando pinças e puxe-a sobre o sistema nervoso. Verifique a remoção bem sucedida pela ausência de melanócitos acima da lâmpada olfativa.Coloque o girino no poço do prato revestido de guarda de célula. Posicione um deslizamento de tampa de vidro revestido com graxa de vácuo alto para cobrir a parte superior do tectum até a extremidade da cauda. Certifique-se de que a lâmpada olfativa e os placodes permaneçam expostos ao meio extracelular.Encha o prato pitri com a solução de Xenopus Ringer contendo 100 tubocurarina micromolar para evitar contrações musculares. Coloque o prato segurando o girino sob um microscópio vertical. Conecte o reservatório contendo a solução de Xenopus Ringer com o prato usando tubos de polietileno para profusão contínua da solução de Xenopus Ringer.Comece a perfundar a solução de Xenopus Ringer. Mantenha o nível da solução na constante prato durante todo o experimento. Avalie continuamente a viabilidade do girino observando a circulação sanguínea através dos vasos.Comece a imagem ao vivo usando um objetivo de baixa ampliação para visualizar o girino. Mova o eixo micromanipulador para colocar o capilar entregando a solução odoante na parte superior de uma cápsula nasal, formando um ângulo de 90 graus com o nervo olfativo. Encontre a lâmpada olfativa localizada ipsilateralmente na cápsula nasal.Mude para um objetivo de água de alta ampliação com uma longa distância de trabalho. Verificar a emissão de floresnças por estruturas i.Glomerulares deve ser óbvio. Comece por tubos de 20 mililitros de solução de aminoácido fresco em um reservatório elevado.Em seguida, pegue seis girinos privados de alimentos de seu tanque de habitação, e coloque-os em dois litros de água de girino limpo para minimizar a exposição aos odores. Coloque um prato de seis poços modificado em um transilluminador LED branco. Encha cada poço com 10 mililitros de água girino.Coloque um girino por poço e deixe descansar por pelo menos três minutos. Inicie a aquisição de imagens e adquira filmes que contenham períodos basais, de estímulo e de recuperação. Uma resposta atraente pode ser detectada como um movimento em direção ao bocal que fornece a solução de aminoácidos.Devolva os animais ao tanque após a imagem. Rastrear posições da cabeça do girino dentro de uma área de 35 milímetros por 35 milímetros, ou o tamanho equivalente em pixels, permite uma análise quantitativa do comportamento guiado olfativo. A linha pontilhada representa a área proximal à entrada da solução de odor.Parcelas individuais de movimentos de girinos são construídas usando coordenadas X Y obtidas pela análise de imagem. Os gráficos de motilidade extraídos devem reproduzir fielmente imagens de vídeo. Uma região de interesse de 8,75 milímetros de raio centrada na entrada da solução é usada para classificar a proximidade dos animais à fonte odoante.Mais tempo gasto nas proximidades do bocal do odor indica tropismo positivo. O tempo gasto por girinos perto do bocal durante períodos definidos, por exemplo, intervalos de 15 segundos, permite identificar a capacidade de detectar soluções de aminoácidos. O comportamento geral de uma população de girinos pode ser obtido plotando a distribuição de dados individuais.O tropismo positivo pode ser detectado quando a solução de aminoácidos é preparada a um mililitro ou 160 micromolar. Os animais não respondem à aplicação da água. Após este procedimento, outros métodos como técnicas histológicas ou eletrofisiologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como a alteração de propriedades sinápticas após a lesão.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área da neurobiologia explorarem o processamento de informações olfativas no girino Xenopus.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Neurociência

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...