Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanciado por Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con premios de investigación competitiva de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, del fondo de becas de Stephen W. Kuffler, Laura y Arturo Colwin verano investigación beca Fondo , la beca de Fischbach y el gran fondo de generación del laboratorio biológico marino y el nacional Xenopus recursos RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) donde se llevó a cabo una parte de este trabajo. También agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional. A.L. es Serra Húnter.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética de investigación animal de la Universidad de Barcelona.
Nota: Los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis son criados según los métodos estándar13,14. Agua de renacuajo es preparado agregando sales comerciales (véase Tabla de materiales) al agua obtenida por ósmosis inversa. Conductividad se ajusta a ∼700 μs y...

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	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. 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Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Este documento describe técnicas que son útiles para investigar la funcionalidad de las vías olfatorias en la vida de los renacuajos de Xenopus . El protocolo actual es particularmente útil para aquellos laboratorios que trabajan o tienen acceso a Xenopus; sin embargo, también es interesante para aquellos investigadores que estudian las bases celulares y moleculares de la regeneración neuronal y reparación. Resultados obtenidos en Xenopus pueden combinarse con datos recogidos en otros mo...

Los renacuajos de Xenopus constituyen un excelente modelo animal para estudiar la función normal del sistema nervioso. Transparencia, un genoma completamente secuenciado1,2y accesibilidad a las técnicas quirúrgicas, electrofisiológicos y de imagenológicos son propiedades únicas de las larvas de Xenopus que permiten investigar las funciones neuronales in vivo3 . Algunas de las múltiples posibilidades experimentales de este modelo animal son ilustrados por los estudios cuidadosos en renacuajo sistemas sensorial y motor4,5,6. Un circuito neuronal particularmente bien adaptado para el estudio de muchos aspectos de procesamiento a nivel de las sinapsis de información es el de sistema olfativo de renacuajo Xenopus 7. En primer lugar, su conectividad sináptica está bien definido: neuronas receptoras olfatorias (ORNs) proyecto para el bulbo olfatorio y establecen contactos sinápticos con las dendritas de células mitrales/tufted dentro de glomérulos para generar mapas de olor. En segundo lugar, sus ORNs continuamente se generan por la neurogénesis durante toda la vida para mantener la funcionalidad de vías olfatorias8. Y en tercer lugar, porque el sistema olfativo muestra una gran capacidad regenerativa, los renacuajos de Xenopus son capaces de reformar completamente su bulbo olfatorio después de ablación9.
En este papel, describimos los enfoques que combinan la proyección de imagen de glomérulos olfativos en los renacuajos vivos con experimentos conductuales para el estudio de la funcionalidad de las vías olfatorias. Los métodos detallados aquí fueron usados para el estudio de la recuperación funcional de conectividad glomerular del bulbo olfatorio de transección del nervio olfatorio10. Datos obtenidos en los renacuajos de Xenopus son representativas de vertebrados desde procesamiento olfativo es evolutivo conservado.
Los métodos descritos se ejemplifican mediante X. tropicalis pero puede implementarse fácilmente en X. laevis. A pesar del tamaño más grande de adultos X. laevis, ambas especies son notablemente similares durante etapas de renacuajo. Las principales diferencias residen en el nivel genomic. X. laevis muestra pobre maleabilidad genética, determinada sobre todo por su genoma tetraploide y tiempo de generación largo (aproximadamente 1 año). En cambio, x. tropicalis es más susceptible a modificaciones genéticas debido a su corto tiempo de generación (5 – 8 meses) y el genoma diploide. Los experimentos representativos se ilustran para animales de tipo silvestre y tres líneas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) y tubb2:GFP (X. laevis).
Las metodologías descritas en el presente trabajo deben considerarse junto con los avances genéticos en el campo de Xenopus . La simplicidad y fácil aplicación de las técnicas presentadas los hace particularmente útiles para evaluar ya descrito mutantes11, así como líneas de Xenopus generadas por CRISPR Cas9 tecnología12. También describimos un procedimiento quirúrgico que se utiliza para nervios olfativos que puede implementarse en cualquier laboratorio de tener acceso a los renacuajos de Xenopus de transectos. Los enfoques utilizan para evaluar las respuestas de calcio presinápticos y comportamiento olfativo guiadas requieren equipamiento específico, aunque en un coste moderado. Metodologías se presentan en una forma simple para promover su uso en grupos de investigación y podrían sentar las bases de análisis más complejos mediante la implementación de mejoras o de la asociación a otras técnicas, es decir,, histológicos o genéticos enfoques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso. Proporcionan múltiples ventajas experimentales, tales como accesibilidad a numerosos métodos de proyección de imagen, técnicas electrofisiológicas y ensayos de comportamiento. El sistema olfativo del renacuajo Xenopus es particularmente idóneo para investigar la función de sinapsis establecidas durante el desarrollo normal o reformado después de la lesión. Aquí, describimos las metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de las larvas de Xenopus . Esbozamos una combinación de medidas en vivo de las respuestas de calcio presinápticos en glomérulos del bulbo olfativo con ensayos de comportamiento olfativo guiado. Métodos pueden combinarse con la transección de nervios olfativos para el estudio de la configuración de la conectividad sináptica. Los experimentos se presentan animales de tipo salvaje y genéticamente modificados expresando reporteros GFP en células del sistema nervioso central. Aplicación de los enfoques descritos a los renacuajos genéticamente modificados puede ser útil para desentrañar las bases moleculares que definen comportamiento vertebrado.

En este trabajo presentamos una combinación de dos enfoques complementarios para realizar el estudio en vivo de la funcionalidad del sistema olfativo renacuajo Xenopus : i) un método para la proyección de imagen presináptica Ca2 + cambios en los glomérulos de la vida los renacuajos con un indicador fluorescente de calcio y ii) un olor guiado ensayo conductual que puede utilizarse para investigar la respuesta a olores específicos de transmitidas por el ag...

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Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Este método puede ser útil para responder preguntas clave en campos de neurobiología como cómo funcionan los terminales presinápticos in vivo. La principal ventaja de este conjunto de técnicas es que mostramos enfoques complementarios para evaluar la función de las vías olfativas utilizando renacuajos Xenopus como modelo animal. Demostrando este procedimiento seremos yo, Beatrice Terni y Paolo Pacciolla.Comience el procedimiento de transección humedeciendo dos trozos de papel de filtro cualitativo de celulosa en una solución anestésica 0,02%MS2 22 y colocándolas bajo el ámbito de disección. A continuación, elija un renacuajo del tanque y sumerja en un plato de solución anestésica. El renacuajo debe dejar de nadar en un plazo de dos a cuatro minutos.Compruebe la anestesia adecuada por la ausencia de una reacción a los estímulos mecánicos aplicados a nivel de cola utilizando pinzas. Coloque el renacuajo anestesiado en el papel de filtro debajo del visor. Coloque el animal con su lado dorsal mirando hacia arriba para que las estructuras cerebrales puedan ser visualizadas.Para experimentos conductuales, usa tijeras veni para transeccar ambos nervios y suprimir toda la información de olores que llega a la bombilla olfativa. Cargue una pipeta de vidrio con dos microlitros de solución de dextrina verde calcio y colóquela en el microinyector. Coloque un renacuajo anestesiado debajo del microscopio de disección sobre el papel de filtro, luego mueva la punta de la pipeta a la cavidad principal de la cápsula nasal y entregue 0,15 a 0,3 microlitros del tinte.Deje el renacuajo en su lugar durante dos o tres minutos. Con una pipeta Pasteur, gotee una solución de 0,02%MS2 22 sobre las partes más de la misión del animal para evitar el secado. Transfiera al animal al tanque de recuperación donde el renacuajo debe recuperar la natación normal en un plazo de 10 minutos.Observar la florescencia a nivel de la capa glomerular de la bombilla olfativa el día después de la inyección. Prepare un renacuajo anestesiado para la toma de imágenes eliminando primero la piel por encima de la bombilla olfativa. Utilice tijeras veni para hacer una incisión lateral en la piel del renacuajo en el borde del sistema nervioso central a nivel de la bombilla olfativa.Evite extender el corte al tectum, que se puede identificar fácilmente por la ubicación del nervio óptico. Mantener el animal húmedo aplicando gotas de 0.02%MS2 22 solución usando una pipeta Pasteur luego pellizcar la piel cortada usando pinzas y tirar de ella sobre el sistema nervioso. Verifique la eliminación exitosa por la ausencia de melanocitos por encima de la bombilla olfativa.Coloque el renacuajo en el pozo del plato recubierto del protector de celda. Coloque un resbalón de cubierta de vidrio recubierto con grasa de alto vacío para cubrir la parte superior del tectum hasta el final de la cola. Asegúrese de que la bombilla olfativa y los placodes permanezcan expuestos al medio extracelular.Llene el plato pitri con la solución de Xenopus Ringer que contiene 100 tubocurarina micromolar para prevenir las contracciones musculares. Coloque el plato que sujeta el renacuajo bajo un microscopio vertical. Conecte el depósito que contiene la solución de Xenopus Ringer con el plato utilizando tubos de polietileno para la profusión continua de la solución de Xenopus Ringer.Empezar a perfunder la solución de Xenopus Ringer. Mantener el nivel de la solución en el plato constante durante todo el experimento. Evaluar continuamente la viabilidad del renacuajo observando la circulación sanguínea a través de los vasos.Comience la toma de imágenes en vivo utilizando un objetivo de baja ampliación para visualizar el renacuajo. Mueva el eje del micromanipulador para colocar el capilar que entrega la solución de olor en la parte superior de una cápsula nasal, formando un ángulo de 90 grados con el nervio olfativo. Encuentre el bulbo olfativo localizado ipsilateralmente a la cápsula nasal.Cambie a un objetivo de agua de alto aumento con una larga distancia de trabajo. Compruebe que la emisión de florescencia por I.Glomerular structures debe ser obvia. Comience por pipetear 20 mililitros de solución de aminoácidos frescos en un depósito elevado.Luego tome seis renacuajos privados de alimentos de su tanque de alojamiento, y colóquelos en dos litros de agua limpia de renacuajo para minimizar la exposición a los olores. Coloque un plato de seis pozos modificado en un transilluminador LED blanco. Llene cada pozo con 10 mililitros de agua de renacuajo.Coloque un renacuajo por pozo, luego deje reposar durante al menos tres minutos. Comience la adquisición de imágenes y adquiera películas que contengan períodos basales, de estímulo y de recuperación. Una respuesta atractiva se puede detectar como un movimiento hacia la boquilla entregando la solución de aminoácidos.Devuelva a los animales a su tanque después de tomar imágenes. El seguimiento de las posiciones de la cabeza del renacuajo dentro de un área de 35 milímetros por 35 milímetros, o el tamaño equivalente en píxeles, permite un análisis cuantitativo del comportamiento guiado por olfativos. La línea punteada representa el área proximal a la entrada de la solución de olor.Las parcelas individuales de movimientos de renacuajo se construyen utilizando coordenadas X Y obtenidas mediante el análisis de imágenes. Las gráficas de motilidad extraídas deben reproducir fielmente imágenes de vídeo. Una región de interés de 8,75 milímetros de radio centrada en la entrada de la solución se utiliza para clasificar la proximidad de los animales a la fuente de olor.Más tiempo pasado en las proximidades de la boquilla del olor indica un tropismo positivo. El tiempo empleado por los renacuajos cerca de la boquilla durante los períodos definidos, por ejemplo, intervalos de 15 segundos, permite identificar la capacidad de detectar soluciones de aminoácidos. El comportamiento general de una población de renacuajos se puede obtener trazando la distribución de datos individuales.El tropismo positivo se puede detectar cuando la solución de aminoácidos se prepara a un milimolar o 160 micromolares. Los animales no responden a la aplicación de agua. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como técnicas histológicas o electrofisiología, para responder preguntas adicionales como la alteración de las propiedades sinápticas después de la lesión.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran el procesamiento de información olfativa en el renacuajo Xenopus.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Investigación

Neurociencias

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

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Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

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The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...