Name: functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) samfinansieras av den Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), av konkurrenskraftig forskning awards från den M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fonden, Laura och Arthur Colwin begåvad sommaren Research Fellowship Fund , den Fischbach gemenskap och stor Generation fonden av den marinbiologiska laboratorium och den nationella Xenopus resurs RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) där en del av detta arbete utfördes. Vi tackar också CERCA Program / Generalitat de Catalunya för institutionellt stöd. A.L. är en Serra Húnter Karl.

Alla förfaranden godkändes av utskottet för forskning på djur-etik vid universitetet i Barcelona.
Obs: X. tropicalis och X. laevis grodyngel föds upp enligt standardmetoder13,14. Grodyngel vatten bereds genom att lägga till kommersiella salter (se Tabell för material) i vatten som erhålls genom omvänd osmos. Ledningsförmåga justeras till ∼700 µS och ∼1, 400 µS för <e...

<ol>
	<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements.">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li><li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons.">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li><li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion.">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).</li><li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies.">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li><li>Stout, R. P., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+olfactory+placode+on+the+development+of+the+brain+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Axonal+growth+and+connections+of+the+transplanted+olfactory+placode.">Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li><li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae.">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li><li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles.">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li><li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis.">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Husbandry+of+Xenopus+tropicalis.">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).</li><li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-grained+fate+maps+for+the+ophthalmic+and+maxillomandibular+trigeminal+placodes+in+the+chick+embryo.">Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo.</a> Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).</li><li>Friedrich, R. W., Korsching, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+and+chemotopic+odorant+coding+in+the+zebrafish+olfactory+bulb+visualized+by+optical+imaging.">Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging.</a> Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis.">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Koide, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neural+circuitry+for+attraction+to+amino+acids+revealed+by+transposon-mediated+gene+trap+approach+in+zebrafish.">Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).</li><li>Truszkowski, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits.">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14 (2016).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System.">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li><li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).</li><li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+(Lithobates)+catesbeiana+tadpoles:+Sensitivity+to+thyroid+hormones,+estrogen,+and+treated+municipal+wastewater+effluent.">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., M&#252;ller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li><li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles.">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li></ol>

Detta dokument beskriver tekniker som är användbara för att undersöka funktionen av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel. Det nuvarande protokollet är särskilt användbart för de laboratorier som arbetar, eller har tillgång till Xenopus; men är det också intressant för de forskare som studerar cellulära och molekylära baserna av neuronala förnyelse och reparation. Resultat som erhållits i Xenopus kan kombineras med uppgifter som samlats in i andra ryggradsdjur modeller för at...

Xenopus grodyngel utgör en utmärkt djurmodell för att studera nervsystemets normala funktion. Öppenhet, fullt sekvenserat genomet1,2och tillgängligheten till kirurgisk, elektrofysiologiska och imaging tekniker är unika egenskaper av Xenopus larver som tillåter undersöker neuronala funktioner i vivo3 . Några av flera experimentella möjligheterna av denna djurmodell illustreras av de grundliga studier som utförts på tadpole sensoriska och motoriska system4,5,6. En särskilt väl lämpad neuronala krets att studera många aspekter av informationsbehandling på nivån av synapser är Xenopus grodyngel luktsystem7. För det första dess synaptic anslutning är väl definierad: luktreceptor nervceller (ORNs) projektet till luktbulben och upprätta synaptiska kontakter med dendriter av mitral/tuftade celler inom glomeruli att generera lukt kartor. För det andra skapas dess ORNs kontinuerligt av neurogenes i hela livet att behålla funktionaliteten på olfactory vägar8. Och för det tredje eftersom luktsinnet visar en stor regenerativ förmåga, Xenopus grodyngel kan helt reformera deras luktbulben efter ablation9.
I detta papper beskriver vi metoder som kombinerar avbildning av lukt glomeruli i levande grodyngel med beteendemässiga experiment för att studera funktionaliteten på olfactory vägar. De metoder som beskrivs här användes för att studera glomerulär connectivity i luktbulben funktionell återhämtning efter luktnerven transection10. Data som erhållits i Xenopus grodyngel är representativa för ryggradsdjur eftersom lukt behandling är evolutionärt bevarade.
De metoder som beskrivs exemplifieras med X. tropicalis men de kan enkelt implementeras i X. laevis. Trots den största storleken av vuxen X. laevisär båda arter anmärkningsvärt liknande under grodyngel stadier. De viktigaste skillnaderna är bosatta på genomisk nivå. X. laevis visar dålig genetisk tractability, mestadels bestäms av dess allotetraploid genomet och lång tid (cirka 1 år). Däremot är X. tropicalis mer mottagliga för genetiska modifieringar på grund av dess kortare generationstid (5 – 8 månader) och diploida genomet. De representativa experiment illustreras för vilda djur och tre olika transgena linjerna: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) och tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder som beskrivs i det nuvarande arbetet bör övervägas tillsammans med de genetiska fortskrider i fältet Xenopus . Den enkelhet och enkel implementering av tekniker presenteras gör dem särskilt användbara för att utvärdera redan beskrivits mutanter11, liksom Xenopus rader genereras av CRISPR-Cas9-teknik12. Vi beskriver också ett kirurgiskt ingrepp som brukade transekt luktsinnet nerver som kan genomföras i ett laboratorium som har tillgång till Xenopus grodyngel. Metoderna som används för att utvärdera presynaptiska calcium svaren och lukt-guidad beteende kräver särskild utrustning, om än på en måttlig kostnad. Metoder presenteras i en enkel form att främja deras användning i forskargrupper och kan ställa baserna av mer komplexa analyser av genomföra förbättringar eller av föreningen till andra tekniker, dvs, histologiska eller genetiska metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)</td>
			<td style="width:359px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:143px;">XPSIO25R</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>WH3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X. laevis tubb2-GFP</td>
			<td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td>
			<td>NXR_0.0035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X.tropicalis NBT-GFP</td>
			<td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellTracker CM-DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-7001</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate capillaries for microinjection</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microinjector</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sylgard-184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microfil micropipettes</td>
			<td style="width:359px;">World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Master-8 stimulator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Image EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Solenoid valves</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6 Six Channel system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>636082B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubocurarine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MRC-5 Camera</td>
			<td>Controlled by Zen software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL8ML3</td>
			<td>There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manifold</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MP-6 perfusion manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator for local delivery of solutions</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini magnetic clamps</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>MAG-7, MAG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of olfactory pathways in living xenopus tadpoles

Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet. De ger flera experimentella fördelar, såsom tillgänglighet till talrika bildgivande metoder, elektrofysiologiska tekniker och beteendemässiga analyser. Xenopus grodyngel Luktsinnet är särskilt väl lämpad att undersöka funktionen av synapser fastställts under normala utveckling eller reformeras efter skada. Här, vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver. Vi beskriva en kombination av invivo mätningar av presynaptiska calcium svaren i glomeruli i luktbulben med lukt-guidad beteende analyser. Metoder kan kombineras med transection av luktsinnet nerver att studera den uppladdning av synaptic anslutning. Experiment presenteras med både vildtyp och genetiskt modifierade djur uttrycker GFP reportrar i centrala nervsystemet celler. Tillämpningen av de metoder som beskrivs till genetiskt modifierade grodyngel kan vara användbart för att nysta upp de molekylära baser som definierar ryggradsdjur beteende.

I detta papper, vi presentera en kombination av två kompletterande metoder att utföra i vivo studie av funktionaliteten i Xenopus grodyngel luktsinnet: jag) en metod för imaging presynaptiska Ca2 + förändringar i glomeruli levande grodyngel med ett fluorescerande kalcium indikator, och ii) guidade en lukt beteendemässiga analysmetod som kan användas för att undersöka specifika vattenburna odoranter svar. Eftersom dessa metoder har använts för att ut...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionell utvärdering av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel

Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet invivo. Vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver under normala uppfödning eller efter skada.

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Denna metod kan vara användbar för att besvara viktiga frågor inom neurobiologiska områden som hur fungerar presynaptiska terminaler in vivo. Den största fördelen med denna uppsättning tekniker är att vi visar gratis metoder för att asses funktionen av luktvägar med hjälp av Xenopus grodyngel som djurmodell. Att demonstrera detta förfarande kommer att vara jag själv, Beatrice Terni, och Paolo Pacciolla.Börja transsektionsförfarandet genom att blöta två bitar av cellulosa kvalitativa filterpapper i 0,02%MS2 22 anestesilösning, och placera dem under dissekering omfattning. Välj sedan en grodyngel från tanken och sänk ner den i en maträtt av anestesilösning. Grodyngel bör sluta simma inom två till fyra minuter.Kontrollera om korrekt anesthetization av frånvaron av en reaktion på mekaniska stimuli tillämpas på svansen nivå med hjälp av pincett. Placera den sövda grodyngel på filterpapperet under räckvidden. Placera djuret med sin ryggsida vänd uppåt så att hjärnstrukturer kan visualiseras.För beteendeexperiment, använd veni sax för att transect båda nerverna att undertrycka alla luktinformation som anländer till luktbulben. Ladda en poled glaspipett med två mikroliter kalciumgrön en dextrinlösning, och placera den i mikroinjektorn. Placera en sövd grodyngel under dissekera mikroskop på filterpapper, flytta sedan spetsen av pipetten i den främsta håligheten i näskapseln, och leverera 0,15 till 0,3 mikroliter av färgämnet.Låt grodyngeln vara på plats i två till tre minuter. Droppa 0,02%MS2 22-lösningen med hjälp av en Pasteurpipett på de mer coddle delarna av djuret för att undvika torkning. Överför djuret till återhämtningstanken där grodyngel bör återhämta normal simning inom 10 minuter eller så.Observera volenscens i nivå med luktbulbens glomerulära skikt dagen efter injektionen. Förbered en sövd grodyngel för avbildning genom att först ta bort huden ovanför luktbulben. Använd veni sax för att göra ett lateralt snitt på grodyngel hud på kanten av det centrala nervsystemet i nivå med luktbulben.Undvik att utöka snittet till tectum, som lätt kan identifieras genom placeringen av synnerven. Håll djuret fuktigt genom att applicera droppar på 0,02%MS2 22-lösning med hjälp av en Pasteurpipett och sedan nypa den avskurna huden med hjälp av pincett och dra den över nervsystemet. Verifiera framgångsrikt avlägsnande genom avsaknad av melanocyter ovanför luktbulben.Placera grodyngel i brunnen av cell vakt belagda skålen. Placera ett glaskåpa slip belagt med högvakuum fett för att täcka toppen av tectum till slutet av svansen. Se till att luktbulben och plakoder förblir utsatta för extracellulära mediet.Fyll pitrifatet med Xenopus Ringers lösning innehållande 100 mikromolokar tubokurarin för att förhindra muskelsammandragningar. Placera skålen som håller grodyngel under ett upprätt mikroskop. Anslut reservoaren som innehåller Xenopus Ringers lösning med skålen med hjälp av polyetylenrör för kontinuerligt överflöd av Xenopus Ringers lösning.Börja perfusing Xenopus Ringers lösning. Bibehålla nivån på lösningen i skålen konstant under hela experimentet. Utvärdera kontinuerligt grodyngels livskraft genom att observera blodcirkulationen genom kärlen.Påbörja live-avbildning genom att använda ett mål med låg förstoring för att visualisera grodyngeln. Flytta micromanipulator axeln för att placera kapillären leverera luktlösning på toppen av en nasal kapsel, bildar en 90 graders vinkel med luktnerven. Hitta luktbulben ligger ipsilaterally till näskapseln.Byt till ett högförstoringsvattenmål med långt arbetsavstånd. Kontrollera florescence utsläpp av I.Glomerular strukturer bör vara uppenbart. Börja med pipettering 20 milliliter av färsk aminosyra lösning i en förhöjd reservoar.Ta sedan sex mat berövade grodyngel från deras bostäder tank, och placera dem i två liter rent grodyngel vatten för att minimera exponeringen för luktämnen. Placera en modifierad sex väl maträtt på en vit LED transilluminator. Fyll varje brunn med 10 milliliter grodyngelvatten.Placera en grodyngel per brunn, låt vila i minst tre minuter. Starta bildförvärv och skaffa filmer som innehåller basala, stimulans- och återställningsperioder. Ett attraktivt svar kan detekteras som en rörelse mot munstycket leverera lösningen av aminosyror.Återför djur till sin tank efter avbildning. Spårning av grodyngelhuvudpositioner inom ett område på 35 millimeter med 35 millimeter, eller motsvarande storlek i pixlar, möjliggör en kvantitativ analys av luktstyrt beteende. Den streckade linjen representerar det proximala området till luktlösningsinloppet.Enskilda tomter av grodyngelrörelser konstrueras med hjälp av X Y-koordinater som erhålls genom bildanalys. De extraherade motility tomter måste troget återge videobilder. En region av intresserar av 8.75 millimetrarradie som centreras på lösningsinloppet, används för att klassificera närheten av djuren till den luktiga källan.Mer tid i närheten av luktdysan indikerar positiv tropism. Tid som spenderas av grodyngel nära munstycket under definierade perioder, till exempel 15 sekunders intervall, möjliggör identifiering av förmågan att upptäcka aminosyralösningar. Det övergripande beteendet hos en population av grodyngel kan erhållas genom att rita fördelningen av enskilda data.Positiv tropism kan detekteras när aminosyralösningen bereds vid en millimolar eller 160 mikromolar. Djur svarar inte på vattenapplikation. Efter detta förfarande, andra metoder som histologiska tekniker eller elektrofysiologi, kan utföras för att besvara ytterligare frågor som ändring av synaptiska egenskaper efter skada.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom neurobiologi att utforska bearbetning av luktinformation i Xenopus grodyngel.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associativ Olfactory Lärande i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enhet inspelning Metoder för att karaktärisera neural aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretsar

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation av Lukt Ensheathing celler att utvärdera funktionell återhämtning efter perifer nervskada

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionell utvärdering av biologisk Nervgifter i nätverkande Kulturer av stamceller som härrör centrala nervsystemet nervceller

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforerade Patch-clamp inspelning av Mouse Olfactory sensoriska neuroner i Intakt neuroepithelium: Funktionell analys av nervceller som uttrycker en identifierad luktreceptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Inspelning Temperatur-inducerad neuronal aktivitet genom att övervaka Kalcium Förändringar i luktbulben av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

En objektiv och reproducerbara Test av lukt lärande och diskriminering i möss

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...