Name: high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS (R01AR065523).

1. אנזים הגבלה בחירה
<ol><li>לזהות אזור בעל עניין (למשל., יזם ג'ין, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ), משפר) ולקבל את רצף ה-DNA ממאגרי כגון המרכז הלאומי לקבלת מידע ביוטכנולוגיה (NCBI).</li>
	<li>לזהות את אנזימי הגבלה של המועמד (במיל ') לעיכול הראשון אנזים הגבלה (RE1) זה לא מספיק בתוך הרצף של עניין, אשר מי...

<ol>
	<li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data.">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Chromosome+Conformation.">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation.">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+chromosome+conformation+capture+(4C)+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions.">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C+technology:+Protocols+and+data+analysis.">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, (2012).</li><li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+(4C-Seq).">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li><li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+(4C-seq).">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li><li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+(4C-seq)+Method.">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li><li>G&#246;nd&#246;r, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay.">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning.">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic4Cseq:+An+R/Bioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data.">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li><li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-ker:+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments.">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li><li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FourCSeq:+analysis+of+4C+sequencing+data.">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data.">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li><li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions.">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li><li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity.">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li><li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease.">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li><li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs.">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787 (2017).</li></ol>

תוצאות 4C יש פוטנציאל לחשיפת אינטראקציות כרומטין לזיהוי רכיבי הרגולציה לא מוכרת ו/או היעד גנים חשובים בהקשר ביולוגי מסוים24,25,26. עם זאת, מכשולים טכניים עלולה להגביל את הנתונים המתקבלים ניסויים אלה. הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של תבנית ב- 4 C פרו...

כבר בהנחייתם של זיהוי רכיבי הרגולציה על ביטוי גנים הפרויקט האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד) באופן מקיף מבואר פעילות פונקציונלית עבור 80% של הגנום האנושי1,2. הזיהוי של האתרים ויוו איגוד פקטור שעתוק, רגישות יתר DNaseI, ואת היסטון epigenetic שינויים מתילציה DNA סוגי תאים בודדים סלל את הדרך הניתוחים פונקציונלי של המועמד רגולטוריות רכיבים של ביטוי גנים היעד. חמושים עם ממצאים אלה, אנו מתמודדים עם האתגר של קביעת את מסופר פונקציונלי בין אלמנטים רגולטוריות גנים. באופן ספציפי, מהו הקשר בין גן יעד נתון enhancer(s) שלה? שיטת הלכידה (3 ג) קונפורמציה כרומטין מטפל ישירות שאלה זו על ידי זיהוי פיזי, וסביר פונקציונליים, האינטראקציות בין אזור עניין לבין המועמד אינטראקציה רצפים דרך אירועים שנתפסו בכרומטין קבוע3 . כפי הבנתנו כרומטין אינטראקציות גדל, עם זאת, ברור כי החקירה של המועמדים שנבחרו מראש לוקוסים אינה מספיקה לספק הבנה מלאה של ג'ין-enhancer אינטראקציות. לדוגמה, קדד השתמש בשיטת עותק מוספר (5 ג) לכידת תפוקה גבוהה קונפורמציה כרומוזומלית לבחון חלק קטן של הגנום האנושי (1%, פיילוט של לוקוסים 44) ודיווח מסופר מורכבים של לוקוסים. גנים ומוצרי טיפוח טבעיים עם אינטראקציות מזוהה בממוצע 2-4 שותפים אינטראקציה שונים, רבים מהם היו מאות kilobases משם, מרחב לינארי4. יתרה מזאת, Li ואח. משמש כרומטין ניתוח האינטראקציה לפי מדגמים מזווגים-End תג רצף (דשא) כדי לנתח את כל הגנום מקדם אינטראקציות ומצא כי 65% של RNA פולימראז II איגוד אתרים היו מעורבים באינטראקציות כרומטין. חלק אינטראקציות אלה גרמו קומפלקסים גדולים, רב הגן משתרע על פני מאות kilobases של מרחק גנומית, המכיל, בממוצע, 8-9 גנים כל5. יחד, ממצאים אלה מדגישות את הצורך שיטות הגנום כולו לא משוחד חקירת האינטראקציות כרומטין. חלק משיטות אלה נבדקות שמיט ואח. 6.
שיטות חדשות יותר ללימודי לכידת קונפורמציה כרומטין יחד עם הדור הבא רצף (Hi-C ו- 4C-seq) לאפשר הגילוי של רצפי לא ידועה אינטראקציה עם אזור של ריבית6. באופן ספציפי, לכידת קונפורמציה כרומוזום מעגלי עם הדור הבא רצפי (4C-seq) פותחה כדי לזהות לוקוסים אינטראקציה עם רצף של עניין לא משוחדת באופן7 על-ידי קביעת רצף ה-DNA של מקורב ל שנתפסו כרומטין אזור עניין במרחב תלת-ממדי. בקצרה, כרומטין קבוע כדי לשמור על אינטראקציות חלבון-DNA המקורי שלה, ביקע עם אנזים ההגבלה ולאחר מכן מאתרים בתנאים שתדללו ללכוד ביולוגית רלוונטית "קשרים" של אינטראקציה לוקוסים (איור 1). הקישורים קרוס מתבטלות כדי להסיר את החלבון, ובכך משאיר ה-DNA זמינים עבור ביקוע חלבונים נוספים עם אנזים ההגבלה השנייה. מצדו הסופי יוצר עיגולים קטנים של לוקוסים אינטראקציה. תחל רצף של עניין משמשות לאחר מכן ליצור ספריה מוגבר של רצפי לא ידוע מן השברים circularized, ואחריו רצף הדור הבא במורד הזרם.
פרוטוקול המובאים כאן, אשר מתמקדת הכנת הדוגמא, הופך את שני שינויים עיקריים ל קיימים 4C-seq שיטות8,9,10,11,12. ראשית, היא משתמשת שיטה המבוססת על qPCR מדעית לקבוע המספר האופטימלי של הגברה מחזורים עבור שלבי הכנה ספריית 4C-seq, ובכך מפחית את הסיכון של הפוטנציאל של הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של ספריות. שנית, היא משתמשת צעד תקציר הגבלה נוספת במאמץ להפחית האחידות של רצפים "פיתיון" ידוע מעכבת בסיס-טלפון מדויק על ידי המכשיר רצף, ומכאן, ממקסם את רצף ייחודי, מקיף ב כל קריאה. פרוטוקולים אחרים לעקוף בעיה זו על-ידי איגוד רבים (12-15),8 4 C-seq ספריות עם פיתיון שונים רצפים ו/או הגבלת אתרים, נפח של ניסויים אשר לא ניתן להשגה על ידי מעבדות אחרות. השינויים המוצגים כאן מאפשרים מספר קטן של ניסויים, דוגמאות, ו/או משכפל באינדקס, איחדו לתוך נתיב אחד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CviQI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0639S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>To be designed by the reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, methanol free</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15172-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSST-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraSieve Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)

זיהוי רכיבי רגולטוריות עבור גן יעד נתון מהווה אתגר טכני משמעותי בשל ההשתנות בגדלים מיצוב ותוצאה של האלמנטים רגולטוריות גן המטרה. התקדמות נעשתה עם התחזית bioinformatic על קיומו פונקציה של proximal שינויים epigenetic המשויך ביטוי גנים מופעל באמצעות אתרי קישור פקטור שעתוק ההכפלה. כרומטין קונפורמציה לכידת מחקרים מהפכה ביכולת שלנו לגלות את הקשר הפיזי כרומטין בין רצפים, אפילו במרחק של הגנום כולו. כרומטין מעגלית קונפורמציה לכידת יחד עם הדור הבא רצפי (4C-seq), בפרט, מיועד לגלות את האינטראקציות כרומטין הפיזי כל האפשריות עבור רצף נתון עניין (התצפית), כגון גן המטרה או רגולציה-תקינה משפר. אסטרטגיות 4C-seq הנוכחית ישירות רצף של תוך נקודת התצפית אבל דורשים רבים, נקודות מבט מגוונות בו-זמנית שנקבע כדי למנוע את האתגרים הטכניים של מדים לבסס מתקשר (הדמיה) עם פלטפורמות רצף ' הדור הבא '. אמצעי אחסון זה של ניסויים לא יכול להיות פרקטי עבור מעבדות רבות. כאן, אנחנו מדווחים בגישה שונה פרוטוקול 4C-seq המשלבת תקציר של אנזים הגבלה נוספים וגם הגברה מבוססת qPCR צעדים שנועדו להקל על לכידה גדול הקריאות רצף מגוונות או להמתיק את הפוטנציאל PCR הטיה, בהתאמה. שיטה 4C ששונה שלנו היא נוטה? המעבדה לביולוגיה מולקולרית סטנדרטי להערכת אדריכלות כרומטין.

ראשי keratinocytes האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש 2-3 שהושלכו neonatal. אל תדאג, במאגר, בתרבית ב KSFM בתוספת עם µg 30/mL יותרת המוח שור לחלץ, 0.26 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, מ"מ 0.09 סידן כלורי (CaCl2 ) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני. התאים היו לפצל שתי מבחנות ואת הבקבוק אחד ?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הרגולציה התמלולית, כגון תפקידן של אינטראקציות כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת לכידה משוחדת יחסית של האינטראקציות עבור לוקוס של עניין. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך אינטראקציות משפר מקדם, זה יכול להיות מיושם גם כדי לזהות סוגים אחרים של אינטראקציות כרומטין.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלוקח כמה ימים לפרוטוקול, ועיצוב פריימר דורש ניסוי וטעייה וכיוון פריימר לא טיפוסי. כדי לשמר אינטראקציות כרומטין בתאים של בחירה, לחצות לקשר אותם על ידי הוספת 9.5 מיליליטר של 1% מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה פורמלדהיד ב PBS לכל 10 מיליון תאים. הדגירה את התאים תוך נדנדה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.מעבירים את צינורות התגובה לקרח כדי להתרוות את תגובת הקישור הצולבת ומוסיפים קרח קר גליצין טוחן אחד לריכוז סופי של 0.125 טוחן ומערבבים על ידי היפוך עדין. לאחר צנטריפוגה ושטיפת התאים על פי פרוטוקול הטקסט, להשעות את גלולה ב 125 microliters של EDTA מילימולרי עם 0.5% SDS ואחד X מעכבי פרוטאז. דגירה ההשעיה התא על קרח במשך 10 דקות.כדי לוודא כי תריס התא הושלם, לערבב שישה microliters של התאים עם שישה microliters של כחול טריפאן על שקופית מיקרוסקופ לכסות עם להחליק כיסוי. הצג מתחת למיקרוסקופ כדי לראות את פנים התאים הכחולים, ותאים ללא מעצורים לבנים. לעיכול ההגבלה הראשון להוסיף 30 microliters של 10 X הגבלת מאגר אנזימים, ו 27 microliters של 20% טריטון X-100 כדי מתלה התא ולהתאים את הנפח הכולל ל 300 microliters עם מים.הסר aliquot 15 microliter ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס כשליטה מעוכלת. לתערובת התגובה הנותרת מוסיפים 200 איחודים של אנזים הגבלה אחד. דגירה לילה בטמפרטורה המתאימה לאנזים בבלוק חימום רועד עם תסיסה של 900 סל"ד.למחרת, להוסיף 200 יחידות נוספות של האנזים ולהמשיך את הדגירה לילה. הסר aliquot 15 microliter ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס כשליטה מתעכלת. כדי לקבוע את יעילות העיכול להוסיף 82.5 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl, pH 7.5, לכל פקד מעוכל ומתעכל.מוסיפים 2.5 מיקרוליטרים של פרוטאינאז K ודגירה במשך שעה אחת ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את הקישור צלב פורמלדהיד. כדי לבודד את הדנ"א המתעכל, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פנול כלורופורם לצינור. מערבבים על ידי מספר היפוכים מהירים כדי להסיר זיהום חלבון שיורית.צנטריפוגה ב 16, 100 G של בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להעביר את השלב המים לצינור חדש. מוסיפים נתרן אצטט, גליקוגן ו-100% אתנול לצינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.דגירה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה כדי לזרז את ה-DNA. צנטריפוגה הצינור ב 16, 100 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 500 microliters של 70% אתנול לשטוף את גלולת ה-DNA.צנטריפוגה ב 16, 100 G של בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת האוויר העל טבעי לייבש את גלולה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות כדי להסיר אתנול שיורית. להשעות מחדש את גלולה מיובשת 50 microliters גרעין מים חופשיים ולהמשיך לקבוע יעילות העיכול על ידי QPCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי להתכונן קשירה, לחמם ולהפעיל את האנזים הגבלה על ידי דגירה של הצינור במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את התוכן של הצינור לצינור חרוט 50 מיליליטר, ולהוסיף מים ללא גרעין, 10 X חיץ ligase, ו T4 DNA ligase. מערבבים בעדינות על ידי מערבולת, ודגירה לילה ב 16 מעלות צלזיוס ולהמשיך כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי להפוך את הקישור הצלב להוסיף 15 microliters של proteinase K ודגירה לילה ב 65 מעלות צלזיוס. למחרת מוסיפים 30 מיקרוליטרים של RNase A, ו דגירה ב 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להמשיך עם בידוד כרומטין, להוסיף שבעה מיליליטר של פנול כלורופורם ומערבבים על ידי מספר היפוכים מהירים.צנטריפוגה הצינור ב 3, 300 G של בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את השלב הממימי לצינור חדש של 50 מיליליטר ומוסיפים מים נטולי גרעין, שלושה נתרן אצטט טוחנת, גליקוגן ו-100% אתנול. מערבבים את התוכן ואת הדגירה ב 80 מעלות צלזיוס שלילי במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינור ב 3, 900 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר את supernatant, ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 10 מיליליטר של קרח קר 70% אתנול. צנטריפוגה ב3, 300 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.מוציאים את העל-טבעי, ומייבשים לזמן קצר את גלולת הכדור בטמפרטורת החדר. ממיסים את גלולה ב 150 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl pH 7.5 ב 37 מעלות צלזיוס. יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס שליליות או להמשיך בעיכול הגבלה שני, קשירה וטיהור דנ"א כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר טיהור DNA, לבצע QPCR באמצעות פריימרים PCR הפוכים וצבעי סייבר ו ROX כדי לקבוע את מספר מחזורי הגברה עבור הגברה PCR הפוכה של רצפי אינטראקציה לא ידוע כמתואר בטקסט. כדי להכין דנ"א לרצף, חתוך את רצפי הפיתיון עם עיכול הגבלה שלישי על ידי עיכול מיקרוגרם אחד של מוצר מטוהר של PCR הפוך, כמו גם צג אנזים הגבלה. הפעל את אנזים ההגבלה המתעכל, או צג RE, על ג'ל אגרוז של ריכוז המתאים לרסיסים הצפויים.לאחר יעילות העיכול נקבע על ידי אלקטרופורזה ג'ל, להמשיך עם טיהור מוצר PCR הפוכה והכנת ספריית רצף, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עיכול הגבלה שלישי חשוב בפרוטוקול זה עבור רצף הדור הבא של לכידת אישור כרומוזום מעגלי. עיכול זה חותך את רצפי פיתיון אשר יכול להקל על זיהוי של אטרקציות כרומטין.אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של צג RE מתעכל הצביעה על עיכול מספיק של מוצר PCR ההופכי מתעכל במקביל. לאחר סיום ארבע קריאות רצף C נחתכו ומופו גנום התייחסות אנושי hg38, באמצעות חבילת תוכנה BWA. רוב קריאות ליישר באתרי הגבלה HindiIII או CviQ1I סמוך לאתרים HindiIII כצפוי.בעת ניסיון הליך זה חשוב לוודא התאים שלך הם lysed ואת הכרומטין מתעכל מספיק. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו משקעים חיסוניים כרומטין או CHIP, ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי גורמי שעתוק המעורבים באינטראקציות כרומטין. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הכרומטין לחקור רשתות רגולטוריות פיזיות.

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...