Name: high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00
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1 制限酵素の選択
<ol><li>関心領域を識別 (e.g。、一塩基多型 (SNP) 遺伝子プロモーター、エンハンサー) と生物工学情報 (NCBI) のための国立センターなどのリポジトリから DNA 配列を取得。</li>
	<li>最初制限酵素消化 (RE1) 後消化、再粘着末端 (オーバー ハングとテルミニ DNA) をプロデュースする、興味のシーケンス内で、カットしないとその活動は阻害されなかった候補者制限の酵素 (解?...

<ol>
	<li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data.">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Chromosome+Conformation.">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation.">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+chromosome+conformation+capture+(4C)+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions.">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C+technology:+Protocols+and+data+analysis.">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, (2012).</li><li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+(4C-Seq).">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li><li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+(4C-seq).">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li><li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+(4C-seq)+Method.">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li><li>G&#246;nd&#246;r, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay.">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning.">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic4Cseq:+An+R/Bioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data.">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li><li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-ker:+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments.">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li><li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FourCSeq:+analysis+of+4C+sequencing+data.">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data.">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li><li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions.">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li><li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity.">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li><li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease.">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li><li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs.">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787 (2017).</li></ol>

4 C の結果規制以前に未知の要素を識別できるクロマチンの相互作用および/特定の生物学的文脈の24,25,26に重要な標的遺伝子を明らかにする可能性があります。ただし、技術的なハードルは、これらの実験から得られたデータを制限可能性があります。4 C のプロトコル テンプレートが過大に増幅から生じる PCR バイアスが?...

遺伝子発現の調節配列の同定は、人間のゲノムの1,2の 80% の機能活動を包括的に注釈百科事典の DNA 要素 (エンコード) プロジェクトによって促進されています。個々 の細胞のタイプの DNA メチル化の修正とエピジェネティックなヒストン DNaseI の過敏症、生体内の転写因子結合部位の同定舗装候補の規制の機能解析の方法ターゲット遺伝子の表現のための要素。これらの知見を武器に、私たちは規制要素と遺伝子の機能的な相互接続性の決定への挑戦に直面されます。具体的には、指定されたターゲット遺伝子とその enhancer(s) との関係は?クロマチン構造のキャプチャ (3 C) メソッド直接関心領域と固定クロマチン3 でキャプチャしたイベントを使用してシーケンスを操作する候補の識別物理的、および可能性があります機能、相互作用によってこの質問に対応します。.クロマチンの相互作用への理解が増すにつれ、しかし、それは事前に選択された候補遺伝子座の調査は遺伝子エンハンサーの相互作用の完全な理解を提供するために不十分である明らかです。たとえば、エンコードは人間のゲノム (1%、パイロット 44 座の設定) のごく一部を調べる高スループット染色体構造キャプチャ カーボン コピー (5 C) 方法を使用し、軌跡の複雑な相互接続性を報告しました。遺伝子と特定された相互作用の増強物多かった線形空間4で離れて kilobases の何百も、2-4 複数の相互作用パートナーの平均。さらに、李ら。対終了タグのシーケンス (嘉ペット) によるクロマチン相互作用解析を使用して全ゲノム プロモーターの相互作用を分析し、RNA ポリメラーゼ II 結合部位の 65% がクロマチンの相互作用に関与していたことを発見します。これらの相互作用のいくつかで起因した大きい、多遺伝子複合体のゲノムの距離、平均を含んでいる kilobases の何百ものスパニング 8 9 遺伝子各5。一緒に、これらの調査結果は、公平なの全ゲノムは染色質相互作用を尋問法の必要性を強調表示します。これらのメソッドのいくつかは、シュミットらで審査されます。6。
最近クロマチン構造キャプチャ研究法と相まって次世代シーケンス (やあ-C と 4 C seq) 有効にする関心6の領域と相互作用する未知のシーケンスの発見。具体的には、次世代シーケンス (seq 4 C) の円の染色体構造のキャプチャは遺伝子座のキャプチャされたクロマチンに近位から DNA の配列によって公平に7に興味のシーケンスとの相互作用を識別するために開発された、3 D 空間に関心の領域。簡単に言えば、クロマチンは、制限の酵素と裂かれ、相互作用する遺伝子座 (図 1) の生物学的関連性の高い「もつれ」をキャプチャする希釈条件下で結紮後そのネイティブ蛋白質 DNA の相互作用を維持するために固定されています。相互リンクは、このように 2 番目の制限の酵素と追加胸の谷間の DNA を残して、タンパク質を削除に逆です。最終的な結紮は、相互作用する遺伝子座の小さい円を生成します。興味のシーケンスにプライマーは、下流の次世代シーケンシングに続いて円形のフラグメントから未知のシーケンスの増幅されたライブラリを生成する使用されます。
既存 4 C seq メソッド8,9,10、11,12に 2 つの主要な変化を試料に焦点を当てて、ここでは、提示されたプロトコルになります。まず、qPCR ベースのメソッドを使用して、経験的判断増幅の最適数 4 C seq ライブラリの準備手順のサイクルし、このようにライブラリが過大に増幅から生じる PCR バイアスの可能性を軽減します。第二に、それはシーケンス装置による正確な基本通話を妨げるし、したがって、それぞれの読み取りにユニークな有益なシーケンスを最大化する知られていた「餌」シーケンスの均一性を減らすための努力で、追加の制限のダイジェスト ステップを使用します。他のプロトコルは、異なる餌シーケンスおよび/または制限のサイト、他の所で達成可能ではないかもしれない実験の量を多く (12-15)8 4 C seq ライブラリをプールすることによってこの問題を回避します。ここに示す変更許可少数の実験のサンプル、および/またはインデックスし、1 車線にプールにレプリケートされます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CviQI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0639S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>To be designed by the reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, methanol free</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15172-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSST-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraSieve Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)

指定されたターゲット遺伝子の調節配列の同定は、ターゲット遺伝子に規制要素の位置決めと効果サイズの変動により重要な技術的な挑戦をポーズします。存在の bioinformatic 予測と節約されたトランスクリプション要因結合サイトを用いた活性遺伝子発現に関連する近位のエピジェネティックな修飾の機能はいくつかの進歩をしました。クロマチン構造キャプチャ研究シーケンスの間、全体のゲノムの内であっても物理的なクロマチン連絡先を発見する我々 の能力をもたらしました。次世代シーケンス (seq 4 C) と相まって円形クロマチン構造キャプチャは特に、ターゲット遺伝子や規制などの興味 (視点) の指定されたシーケンスのすべての可能な物理的なクロマチンの相互作用を発見する設計エンハンサー。現在 4 C seq 戦略が直接みた内からシーケンスが、多数を必要として制服の技術的な課題を避けるために同時にシーケンスする多様な観点からベース次世代シーケンシング プラットフォーム (画像) を呼び出します。この実験は、多くの実験室の実用的なできない場合があります。ここで、追加の制限の酵素のダイジェストと多様なシーケンス リードの大きいキャプチャを容易にするための潜在性を軽減するために設計されている qPCR ベースの増幅の手順の両方を組み込んだ 4 C seq プロトコルに変更されたアプローチを報告します。PCR バイアス、それぞれ。私たちの修正 4 C 法はクロマチンのアーキテクチャを評価するための標準的な分子生物学研究室に従う義務があります。

プライマリ ヒト角 2-3 捨てられた新生児包皮から分離した、プール、および補足 KSFM で培養した 30 μ g/ml ウシ脳下垂体抽出物、0.26 ng/mL 組換えひと上皮成長因子、0.09 mM 塩化カルシウム (CaCl2) 37 ° c、5% 炭酸ガス。セルに分割された 2 つのフラスコと 1 つのフラスコ増殖から 1.2 mM 72 h 107セルのための最終的な集中に CaCl2の付加によって区別され?...

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability を最大化します。

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

この方法は、クロマチン相互作用の役割など、転写調節分野の主要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、関心のある遺伝子座に対する相互作用の比較的公平なキャプチャを提供することです。この方法はプロモーターエンハンサー相互作用に関する洞察を提供することができるが、他のタイプのクロマチン相互作用を同定するために適用することもできる。一般的に、この方法に新しい個人は、プロトコルのために数日かかるため苦労し、プライマーの設計には試行錯誤と非定型プライマーの向きが必要です。選択した細胞におけるクロマチン相互作用を維持するために、1000万個の細胞あたりPBSに1%電子顕微鏡グレードホルムアルデヒドの9.5ミリリットルを加えることによってそれらを架橋する。室温で10分間揺れながら細胞をインキュベートします。反応管を氷に移してクロスリンク反応を消光し、氷冷1モルグリシンを最終濃度の0.125モルに加え、穏やかな反転によって混ぜます。テキストプロトコルに従って遠心分離して細胞を洗浄した後、0.5%SDSおよび1つのXプロテアーゼ阻害剤を用いて5ミリモルEDTAの125マイクロリットルのペレットを再び懸濁させる。氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。細胞のlyseが完全であることを確認するために、顕微鏡スライド上のトリパンブルーの6マイクロリットルと細胞の6マイクロリットルを混合し、カバースリップで覆います。顕微鏡下で見て、細胞の内部を青色に見せ、未分解細胞を白く見る。最初の制限消化のために10 X制限酵素バッファーの30マイクロリットル、20%トリトンX-100の27マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、水で300マイクロリットルに総容量を調節する。15マイクロリットルのアリコートを取り除き、未消化のコントロールとして摂氏4度で保存します。残りの反応混合物に制限酵素1の200個のユニスを加える。900 RPM攪拌を伴う振度加熱ブロック内の酵素に適した温度で一晩インキュベートする。翌日、酵素を200単位追加し、このインキュベーションを一晩継続します。15マイクロリットルのアリコートを取り除き、消化されたコントロールとして摂氏4度で保存します。消化効率を決定するために、10ミリモルトリス-HClの82.5マイクロリットル、pH 7.5を、各未消化および消化されたコントロールに加える。2.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、65°Cで1時間インキュベートし、ホルムアルデヒドの架橋を逆にします。消化したDNAを分離するには、100マイクロリットルのフェノールクロロホルムをチューブに加えます。いくつかのクイック反転によって混合し、残存タンパク質汚染を除去します。16で遠心分離機、100 Gは室温で5分間。遠心分離後、水相を新しいチューブに移します。酢酸ナトリウム、グリコーゲン、100%エタノールをチューブに加え、反転して軽く混ぜます。DNAを沈殿させるために1時間マイナス80度でインキュベートする。チューブを16、100 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を取り除き、500マイクロリットルの70%エタノールを加え、DNAペレットを洗浄します。16で遠心分離機、100 Gは室温で5分間。上清空気を除去した後、ペレットを室温で2分間乾燥させて、残留エタノールを除去する。乾燥ペレットを50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再び懸濁し、テキストプロトコルに記載されているようにQPCRによる消化効率の決定に進みます。ライゲーションの準備のため、65°Cでチューブを20分間インキュベートして制限酵素を加熱し活性化します。次いで、チューブの内容物を50ミリリットルの円錐管に移し、ヌクレアーゼを含まない水、10 Xリガーゼバッファー、およびT4 DNAリガーゼを加える。渦巻きで軽く混ぜ、摂氏16度で一晩インキュベートし、テキストプロトコルに記載されているように進みます。逆交リンクするには、15マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートする。翌日、RNase Aを30マイクロリットル加え、摂氏37度で45分でインキュベートします。クロマチンの分離を続けるには、フェノールクロロホルムの7ミリリットルを追加し、いくつかの迅速な反転によって混合します。室温で3,300Gでチューブを15分間遠心する。遠心分離後、水相を新しい50ミリリットルチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水、酢酸ナトリウム、グリコーゲン、および100%エタノールを3個加えます。内容物を混ぜ合わせ、マイナス80°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを摂氏4度で3、900Gで20分間遠心分離する。上清を取り出し、10ミリリットルの氷冷70%エタノールでペレットを洗います。摂氏4度で3、300Gの遠心分離機を15分間。上清を取り出し、ペレットを室温で短時間乾燥させます。ペレットを摂氏37度で10ミリモルトリス-HCl pH 7.5の150マイクロリットルに溶解します。負の20°Cで保存するか、テキストプロトコルに記載されているように第二の制限消化、ライゲーション、およびDNA精製を継続します。DNA精製後、逆PCRプライマーおよびサイバーおよびROX色素を用いてQPCRを行い、テキストに記載されているように未知の相互作用配列の逆PCR増幅のための増幅サイクルの数を決定する。シーケンシング用のDNAを調製するには、逆PCRの精製物の1マイクログラムと制限酵素モニターを消化して、第3の制限消化で餌配列を切り取ります。消化された制限酵素、またはREモニタを、予想される断片に適した濃度のアガロースゲル上で実行します。ゲル電気泳動によって消化効率が決定されたら、テキストプロトコルに記載されているように、逆PCR産物の精製およびシーケンシングライブラリの調製を続けます。第3の制限消化は、円形染色体確認捕捉の次世代シーケンシングのためにこのプロトコルにおいて重要である。この消化は、クロマチンのアトラクションの同定を容易にすることができる餌配列をトリミングします。消化されたREモニタのアガロースゲル電気泳動は、並列に消化された逆PCR産物の十分な消化を示した。4つのCシーケンシング読み取りを終了した後、BWAソフトウェアパッケージを使用して、ヒト参照ゲノムhg38にトリミングされ、マッピングされた。読み取りの大半は、ヒンディーIIIサイトに隣接する制限サイトHindiIIIまたはCviQ1Iサイトで期待通りに整列します。この手順を試みている間、あなたの細胞が溶解し、クロマチンが十分に消化されていることを確認することが重要です。この手順に従って、クロマチン免疫沈殿またはCHIPのような他の方法は、クロマチン相互作用に関与する転写因子を同定するなどの追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、クロマチン分野の研究者が物理的な規制ネットワークを探索する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を用いたサルモネラバイオフィルムにおけるCsgD調節標的の発見

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...