Name: high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

Bu eser NIAMS (R01AR065523) tarafından desteklenmiştir.

1. Restriksiyon enzimi seçimi
<ol><li>Bir bölge ilgi tanımlamak (Örn., gen organizatörü, tek nükleotit polimorfizmi (SNP), artırıcı) ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) için Ulusal Merkezi gibi depoları DNA dizisi elde.</li>
	<li>Bu faiz, sıra içinde hangi yapışkan uçlar (DNA termini çıkıntılar ile) sonra sindirim üretmek uygun ve faaliyetlerini tarafından inhibe değil ilk Restriksiyon enzimi sindirim için (RE1) aday enzimleri (REs) tanımlamak KSY metilasyonu. Not: Veri çözümlenmesi R...

<ol>
	<li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data.">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Chromosome+Conformation.">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation.">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+chromosome+conformation+capture+(4C)+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions.">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C+technology:+Protocols+and+data+analysis.">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, (2012).</li><li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+(4C-Seq).">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li><li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+(4C-seq).">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li><li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+(4C-seq)+Method.">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li><li>G&#246;nd&#246;r, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay.">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning.">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic4Cseq:+An+R/Bioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data.">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li><li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-ker:+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments.">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li><li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FourCSeq:+analysis+of+4C+sequencing+data.">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data.">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li><li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions.">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li><li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity.">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li><li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease.">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li><li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs.">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787 (2017).</li></ol>

4C sonuçları önceden bilinmeyen düzenleyici elemanlarının tanımlayabilirsiniz kromatin etkileşimleri ve/veya bir belirli biyolojik bağlamda24,25,26yılında önemli hedef genleri ortaya potansiyeline sahip. Ancak, teknik engellerin Bu deneylerden elde edilen veriler sınırlayabilir. 4 C protokolleri şablonunda aşırı amplifikasyon kaynaklanan PCR önyargı olasıdır. Bu iletişim kuralı döngüleri amplifikasyon e...

Gen ekspresyonu için düzenleyici elemanlarının tanımlaması tarafından kapsamlı bir şekilde insan genomu1,%280'i için fonksiyonel etkinlik açıklamalı DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) proje kolaylaştırdı. Vivo transkripsiyon faktörü bağlama, DNaseI aşırı duyarlılık ve epigenetik histon ve tek hücre türleri olarak DNA metilasyonu değişiklikleri için sitelerin kimlik fonksiyonel analizleri aday düzenleyici açtı öğeler için hedef gen ekspresyonu. Bu bulgular ile silahlı, biz düzenleyici elemanlarının ve genler arasındaki işlevsel Birleştiricisi belirleme sorun ile karşı karşıya olan. Özellikle, belirli hedef gen ve onun enhancer(s) ilişkisi nedir? Kromatin conformation yakalama (3C) yöntemi doğrudan bir bölge ilgi ve etkileşim dizileri ile yakalanan olayların sabit kromatin3 aday arasında tanımlayıcı fiziksel ve büyük olasılıkla fonksiyonel, etkileşimler tarafından bu soru adresleri . Etkileşimleri kromatin anlayışımız olarak, ancak, bu önceden seçilmiş aday loci incelenmesi gen-artırıcı etkileşimleri tam bir anlayış sağlamak yetersiz olduğu açıktır. Örneğin, kodla insan genomu (44 loci ayarla % 1, pilot) küçük bir bölümünü incelemek için kullanılan yüksek üretilen iş kromozom conformation yakalama karbon kopya (5 C) yöntem ve karmaşık Birleştiricisi loci bildirdi. Genler ve arttırıcılar ile tanımlanan etkileşimleri birçoğu kilobases doğrusal alanı4uzaklıkta bulunan yüzlerce edildi 2 – 4 farklı etkileşen ortakları ortalama. Ayrıca, Li ve ark. Çiftli-bitiş etiketi sıralama (çim) göre kromatin etkileşimi analiz bütün-genom organizatörü etkileşimleri analiz ve RNA polimeraz II bağlayıcı siteleri % 65'i kromatin etkileşimleri dahil bulundu için kullanılır. Bu etkileşimler bazıları büyük, çok gen kompleksleri kilobases genomik mesafe ve içeren, ortalama olarak, yüzlerce spanning her58-9 genler sonuçlandı. Birlikte, bu bulgular kromatin etkileşimleri sorguya tarafsız bütün-genom yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Bu yöntemlerden bazıları Schmitt ve arkiçinde incelenir. 6.
Kromatin conformation yakalama çalışmaları için daha yeni yöntemler bilinmeyen dizileri faiz6bölge ile etkileşim keşfi yeni nesil (Hi-C ve 4 C-seq) sıralama etkinleştir ile birleştiğinde. Özellikle, yeni nesil sıralama (4C-seq) ile dairesel kromozom conformation yakalama yakalanan kromatin proksimal için gelen DNA sekanslama tarafından bir tarafsız şekilde7 ilgi bir dizi ile etkileşim loci tanımlamak için geliştirilmiştir 3B alanda ilgi bölgesi. Kısaca, kromatin Restriksiyon enzimi ile i ciddi ve daha sonra etkileşen loci (Şekil 1) biyolojik ilgili "düğüm" yakalamak için sulu şartlarda bakmaksızın onun yerli protein-DNA etkileşimleri korumak için sabittir. Çapraz bağlantılar böylece ek bölünme için kullanılabilir DNA ile ikinci bir Restriksiyon enzimi bırakarak protein kaldırmak için tersine çevrilir. Son ligasyonu etkileşen loci daha küçük daireler oluşturur. Astar ilgi sıralaması için daha sonra aşağı akım sonraki nesil sıralama tarafından takip circularized parçaları, bilinmeyen sıralarının güçlendirilmiş bir kütüphane oluşturmak için kullanılır.
Numune hazırlama üzerinde duruluyor, burada anlatılan Protokolü varolan 4 C-seq yöntemleri8,9,10,11,12iki önemli değişiklikler yapar. İlk olarak, ampirik olarak amplifikasyon en uygun sayısı 4 C-seq Kütüphane hazırlık adımları için döngüleri ve böylece kitaplıkları aşırı amplifikasyon dallanma PCR önyargı olasılığını açığının belirlemek için qPCR tabanlı yöntemi kullanır. İkinci olarak, bu bir ek kısıtlama Özet adım bir çaba doğru Bankası-tarafından sıralama enstrüman arama engel ve dolayısıyla, benzersiz, bilgilendirici sırası her okuma en üst düzeye çıkarır bilinen "yem" dizileri tekdüzelik azaltmak için kullanılır. Diğer iletişim kuralları bu sorun birçok (12-15)8 4 C-seq kitaplıklar farklı yem dizileri ve/veya kısıtlama siteleri, diğer laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir olmayabilir deneyler hacmi ile havuzu tarafından aşmak. Burada sunulan değişiklikler izin ver deneyler, az sayıda örnekleri ve/veya dizin ve bir tek şeride havuzlu çoğaltır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CviQI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0639S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>To be designed by the reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, methanol free</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15172-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSST-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraSieve Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)

Verilen hedef gen düzenleyici elemanlarının tanımlaması için bir hedef gen düzenleyici elemanlarının konumlandırma ve etkisi boyutları değişkenlik nedeniyle önemli bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bazı bioinformatic tahmin varlığı ve proksimal korunmuş transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri kullanarak aktif gen ekspresyonu ile ilişkili epigenetik değişiklikler fonksiyonu ile ilerlemeler kaydedilmiştir. Kromatin conformation yakalama çalışmaları yeteneğimizi fiziksel kromatin kişiler dizileri arasında ve tüm bir genom içinde bile keşfetmek için devrim. Dairesel kromatin conformation yakalama (4 C-seq), yeni nesil sıralama ile birleştiğinde özellikle, belirli bir sıra için olası tüm fiziksel kromatin etkileşimler (bakış), ilgi keşfetmek için bir hedef gen veya bir düzenleyici gibi tasarlanmıştır geliştirici. Geçerli 4C-seq stratejileri doğrudan bakış açısı içinde sıra ama çok sayıda gerektiren ve aynı anda üniforma teknik sorunları önlemek için sıralı için farklı bakış açıları (görüntüleme) arama sonraki nesil sıralama platformları ile baz. Bu birimin deney birçok laboratuarlar için pratik olmayabilir. Burada, bir ek Restriksiyon enzimi Özet ve farklı sıra okuma büyük bir yakalama kolaylaştırmak ve olasılığını azaltmak için tasarlanmış qPCR tabanlı amplifikasyon adımları içermektedir 4 C-seq protokolü için değiştirilmiş bir yaklaşım raporu PCR önyargı, anılan sıraya göre. Bizim tarihinde 4C mükellef kromatin mimari değerlendirmek için standart moleküler biyoloji laboratuarında yöntemidir.

Birincil insan Lenfositi 2-3 atılan yenidoğan foreskins izole edildi, havuza alınan ve kültürlü takıma KSFM 30 µg/mL ile sığır hipofiz özü, 0,26 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü ve 0.09 mM kalsiyum klorür (CaCl2 ) 37 ° c, % 5 karbon dioksit. Hücreleri iki şişe ayrılmış ve bir şişeye CaCl2 ek tarafından Proliferasyona üzerinden 72 h. 107 hücreler her için 1,2 mM son bir konsantrasyon için Ayrıştırılan ve n...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Bu yöntem, kromatin etkileşimlerinin rolü gibi transkripsiyonel düzenleme alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilgi bir çekirge için etkileşimleri nispeten tarafsız bir yakalama sağlar. Bu yöntem, organizatör arttırıcı etkileşimleri hakkında bilgi sağlasa da, diğer renk etkileşimlerini tanımlamak için de uygulanabilir.Genellikle, bu yönteme yeni bireyler protokol için birkaç gün sürer, çünkü mücadele edecek ve astar tasarımı deneme yanılma ve atipik astar oryantasyon gerektirir. Tercih edilen hücrelerdeki kromatin etkileşimlerini korumak için, 10 milyon hücre başına PBS'ye %1 elektron mikroskobu sınıfı formaldehit in 9.5 mililitre ekleyerek çapraz bağlantı kurun. Oda sıcaklığında 10 dakika sallayarak hücreleri kuluçkaya yatırın.Çapraz bağlantı reaksiyonu söndürmek için buz reaksiyonu için reaksiyon tüpleri aktarın ve 0.125 azı lakin son konsantrasyonuna buz gibi bir azı glisin ekleyin ve nazik inversiyon ile karıştırın. Metin protokolüne göre hücreleri santrifüj edip yıkadıktan sonra, %0,5 SDS ve bir X proteaz inhibitörleri ile beş milimolar EDTA'nın 125 mikrolitresinde peleti askıya alın. Hücre süspansiyonuna 10 dakika kuluçkaya yat.Hücre lise sinin tamamlandığından emin olmak için, altı mikrolitre hücreyi altı mikrolitrelik trypan mavisi mikrolitreyi mikroskop slaytına karıştırın ve üzerini kapak fişi ile kapatın. Lysed hücrelerinin içini mavi ve unlysed hücrelerin beyaz görmek için bir mikroskop altında görüntüleyin. İlk kısıtlama sindirim için hücre süspansiyon için 10 X restriksiyon enzim tampon 30 mikrolitre ekleyin ve 27 mikrolitre 20% Triton X-100 ve su ile 300 mikrolitre toplam hacmi ayarlayın.15 mikrolitrelik bir aliquot çıkarın ve sindirilmemiş kontrol olarak dört derece santigrat de saklayın. Kalan reaksiyon karışımı için 200 restriksiyon enzim bir birleştirir ekleyin. 900 RPM ajitasyon ile sallayarak ısıtma bloğunda enzim için uygun sıcaklıkta gece boyunca kuluçka.Ertesi gün, enzim ek 200 birim ekleyin ve bu kuluçka gece devam edin. 15 mikrolitrelik bir aliquot çıkarın ve sindirilmiş kontrol olarak dört derece santigrat de saklayın. Sindirim verimliliğini belirlemek için her sindirilmemiş ve sindirilmiş kontrollere 82,5 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl, pH 7,5 ekleyin.Formaldehit çapraz bağlanmasını tersine çevirmek için 65 santigrat derecede 2,5 mikrolitre proteinaz K ve kuluçka ya da 65 derece ye ekleyin. Sindirilmiş DNA'yı izole etmek için tüpe 100 mikrolitre fenol kloroform ekleyin. Artık protein kontaminasyonunu gidermek için birkaç hızlı inversiyon ile karıştırın.Santrifüj 16, 100 Gr oda sıcaklığında beş dakika. Santrifüjden sonra sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Tüpe sodyum asetat, glikojen ve %100 etanol ekleyin ve ters çevrilerek hafifçe karıştırın.DNA'yı çökeltmek için eksi 80 derecede bir saat kuluçkaya yat. Tüpü 16, 100 G's'de 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve sonra DNA pelet yıkamak için% 70 etanol 500 mikrolitre ekleyin.Santrifüj 16, 100 Gr oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant hava çıkardıktan sonra iki dakika boyunca oda sıcaklığında pelet kuru artık etanol kaldırmak için. Re 50 mikrolitre nükleaz serbest su kurutulmuş pelet askıya ve metin protokolüaçıklandığı gibi QPCR tarafından sindirim verimliliğini belirlemek için devam.Ligasyon için hazırlamak için, ısı ve 65 santigrat derece 20 dakika tüp kuluçka tarafından restriksiyon enzimi etkinleştirin. Sonra 50 mililitrelik konik tüp için tüp içeriğini aktarın ve nükleaz içermeyen su ekleyin, 10 X ligaz tampon, ve T4 DNA ligaz. Girdap yaparak hafifçe karıştırın ve gece boyunca 16 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin.Çapraz bağlantı ters çevirmek için proteinaz K 15 mikrolitre ekleyin ve 65 santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün 30 mikrolitre RNase A ekleyin ve 37 santigrat derecede 45 dakikada kuluçkaya yatın. Kromatin izolasyonu ile devam etmek için, fenol kloroform yedi mililitre ekleyin ve birkaç hızlı inversions tarafından karıştırın.Tüpü 3, 300 G'de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, sulu fazı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve çekirdeksiz su, üç molar sodyum asetat, glikojen ve %100 etanol ekleyin. İçeriği karıştırın ve bir saat boyunca negatif 80 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra tüpü 3, 900 G'de 4 derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve sonra buz soğuk 10 mililitre ile pelet yıkayın 70%etanol. Santrifüj 3, 300 G'de 4 santigrat derecede 15 dakika.Supernatant çıkarın ve kısaca oda sıcaklığında pelet kuru. Pelet 150 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl pH 7.5 37 santigrat derece çözün. Negatif 20 santigrat derecede saklayın veya metin protokolünde açıklandığı gibi ikinci kısıtlama sindirim, ligasyon ve DNA arınması ile devam edin.DNA arınmasını takiben, metinde açıklandığı gibi bilinmeyen etkileşimli dizilerin ters PCR amplifikasyonu için amplifikasyon döngülerinin sayısını belirlemek için ters PCR astarları ve siber ve ROX boyaları kullanarak QPCR gerçekleştirin. Dna'yı sıralamaya hazırlamak için, ters PCR'nin saflaştırılmış bir ürününün bir mikrogramını ve restriksiyon enzim monitörünü sindirerek üçüncü kısıtlama sindirimi ile yem dizilerini kesinleştirin. Sindirilmiş restriksiyon enzimini veya RE monitörünü beklenen parçalara uygun bir konsantrasyonun agarose jeli üzerinde çalıştırın.Sindirim verimi jel elektroforez ile belirlendikten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ters PCR ürün arınması ve sıralama kitaplığı hazırlanması ile devam edin. Dairesel kromozom onay yakalama yeni nesil sıralama için üçüncü kısıtlama sindirim bu protokolde önemlidir. Bu sindirim kromatin konumlar belirlenmesini kolaylaştırabilir yem dizileri kapalı kırpar.Sindirilmiş RE monitörün Agarose jel elektroforezi, paralel olarak sindirilen ters PCR ürününün yeterli şekilde sindirimini göstermiştir. Dört C sıralama okuma bittikten sonra kesilmiş ve insan referans genom hg38 eşlenen, BWA yazılım paketi kullanılarak. Okumaların çoğu beklendiği gibi HindiIII sitelerine bitişik olan hindiiii veya CviQ1I sitelerinde hizalanır.Bu işlemi denerken hücrelerinizin lysed ve kromatin yeterince sindirilir emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kromatin immün çökeltisi veya CHIP gibi diğer yöntemler, kromatin etkileşimlerinde rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi gibi ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra kromatin alanındaki araştırmacıların fiziksel düzenleyici ağları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...