Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00
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Gli autori vorrebbero dopo impianto di microscopia Jenkins all'Università del Wyoming per il loro aiuto e i membri del laboratorio Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana di Subash, per assistenza nella cura degli animali. Questa pubblicazione è stato reso possibile da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto Grant n. 2P20GM103432.

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.
1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione
Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
Nota: In vivo la fissazione d...

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio13. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando i...

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori1. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.
Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose4,,5,6 chiare . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 18567ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche8. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi10. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.
Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione 11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) 11,13,14,15 .
La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni16. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.
Oltre alla macchiatura17blu di toluidina, un argento che macchia il metodo18 e di colorazione tricromica di Masson4 utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati4. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.
Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso19. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.
Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura20. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamen...

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Ricerca

Neuroscienze

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...