Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

ونود أن نشكر الدكتور إريك أليان (UCSF) للمدخلات الفكرية في تصميم هذه الإجراءات، الدكتور مايكل وارد (المعاهد الوطنية للصحة) للمشورة التقنية بشأن المفاضلة إينيورون، و "سابا برلاس" لتحليل الصورة الأولية.

1-الخلية الثقافة وإعداد كاشف
ملاحظة: يتم كتابة البروتوكولات في هذا القسم بالترتيب الذي تظهر به في البروتوكول التمييز (المادة 2). انظر الجدول للمواد اللازمة للمواد وإعداد النشرة المصورة.
<ol><li>
إعداد لوحات المغلفة للخلية والثقافة.
	<ol>
<li>تمييع الحل طلاء المصف...

في هذا البروتوكول، يمكننا وصف أسلوب منهجي لإنتاج 3D مجالات كوكولتوريس العصبية. المجالات تتألف من أستروسيتيس، والخلايا العصبية، مستمدة بشكل مستقل من هبسكس. على الرغم من عدم تركيز هذا البروتوكول، توليد نقية السكان astrocytes من هبسكس28 خطوة بالغة الأهمية ويمكن أن يكون تحديا تقنيا إذ...

أستروسيتيس نوع خلية الدبقية عالية وفيرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع مجموعة متنوعة من المسؤوليات الوظيفية خارج نطاق الدعم الهيكلي. من خلال إفراز العوامل سينابتوجينيك للذوبان ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، المعونة astrocytes في إنشاء وتجميع نهايات ناضجة خلال التنمية1. كما تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على الصحة واللدونه من الاشتباكات العصبية إلى خارج الخلية إشارات2،3،،من45، والإسهام في تحقيق الاستقرار الطويل الأجل من التماثل الساكن البيئات التي تنظم البوتاسيوم خارج الخلية وغلوتامات، فضلا عن إفراز ركائز الطاقة و ATP6،،من78. وأخيراً، يمكن أن تسهم إسهاما كبيرة بالتأثير على تيارات اكستراسينابتيك9، وغير مباشر يمكن أن تؤثر في النشاط من خلال أنواع الخلايا الأخرى مثل تعزيز مييلينيشن10. الأهم من ذلك، لأنه شذوذ أو خلل وظيفي من أستروسيتيس يمكن أن يؤدي إلى العديد من المتلازمات النمائية العصبية وأمراض الأعصاب الكبار، هناك حاجة واضحة لتشمل astrocytes جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية داخل هندسة الشبكات العصبية من أجل تحسين نموذج للبيئة الدماغ الذاتية. سمة لا يتجزأ من أستروسيتيس هو قدرتهم على النموذج التفاعلات الدينامية مع نهايات الخلايا العصبية1،،من1112. في حالة عدم إطلاق، تشكل الخلايا العصبية لعدد محدود من نقاط الاشتباك العصبي، بصورة عامة كما تفتقر إلى النضج الوظيفي13.
Astrocytes البشرية عرض الخصائص المورفولوجية والنسخي والوظيفية – مثل الزيادة في حجم وتعقيد الجينات التفريع، فضلا عن إبلاغها – التي لا يرد موجز لها في القوارض12،14، 15. ونتيجة دراسات استخدام الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك)-مشتقة من الخلايا العصبية وقد تصبح مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لدراسة الأمراض المتصلة بالجهاز العصبي المركزي في المختبر أثناء تطوير علاجات جديدة ونماذج الضرر ونماذج الثقافة16 ،17. وعلاوة على ذلك، تسمح هبسكس دراسة تشكيل المشبك البشرية ووظيفة دون الحاجة للأنسجة الابتدائية18،19.
حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات صلة من الدماغ البشري. وهناك حاجة إلى منبر مناسب الخص شبكاته متشابك مع الدقة العالية وإمكانية تكرار نتائج. في الآونة الأخيرة، برز اهتمام في إنتاج نظم الثقافة 3D (على نطاق واسع يعرف باسم 'أورجانويدس'، 'الماغنيسيوم'، أو 'ميني العقول')20 نموذج معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لهياكل على المستويين الخلوي والكلى. الاحتفاظ الثقافة 3D نظم إدارة المحتوى في المؤسسة وخلية خلية التفاعلات التي تكون عادة غائبة أو محدودة خلال كوكولتوري 2D نموذجية نماذج21،22. توجد وفرة تقنيات استزراع الماغنيسيوم العصبية 3D24،،من2325؛ بيد كثيرة تتطلب فترات طويلة من الثقافة (أشهر إلى سنوات) للتنمية عفوية والحفاظ على طبقة، مع المستخدم نستعرض القليل جداً من التحكم في الإخراج.
هنا، نحن توضيح أسلوب منهجي لسرعة واستمرار التفاعلات العصبية بيونجينير بين أنواع متعددة من الخلايا (الخلايا العصبية قبل متمايزة و astrocytes) مستمدة من هبسكس بتجميع الخلايا في مجال كوكولتوريس ('الكويكبات')26 أن الخص التعقيدات الخاصة بالإنسان المورفولوجية في 3D. يولد هذا الجهاز العصبي عالي الكثافة موزعة بالتساوي المخططات العصبية التي تأخذ على خصائص ناضجة مع مرور الوقت ويمكن فحص أو جزيئي في طريقة الفائق. علينا أن نظهر للمرة الأولى أن أستروسيتيس البشرية الحث على نشاط الشبكة متشابك الاندفاع في هذه كوكولتوريس ثلاثي الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا البروتوكول لا يمكن تكييفها بسهولة لإنشاء مجالات ذات أحجام مختلفة، الاستفادة من الخلايا المحددة لمختلف الهويات الإقليمية من الجهاز العصبي المركزي، ودراسة التفاعلات بين العديد من أنواع الخلايا الأخرى كما هو مطلوب.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات الصلة لدراسة الدماغ البشري. التكنولوجيا الناشئة واحد للتصدي لهذه المشكلة هو استخدام الأبعاد (3D) الخلايا العصبية الثقافات الثلاث، ووصف 'أورجانويدس' أو 'الماغنيسيوم'، للحفاظ على المدى الطويل للتفاعلات بين الخلايا، بما في ذلك جزيئات الالتصاق خارج الخلية. ومع ذلك، هذه الأنظمة الثقافة مضيعة للوقت ولا يتم إنشاؤه بشكل منهجي. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سرعة واستمرار إنتاج 3D كوكولتوريس من الخلايا العصبية وأستروسيتيس من البشر pluripotent الخلايا الجذعية. فصل astrocytes أولاً، قبل متمايزة وفروعه الخلايا العصبية وتحسب. بعد ذلك، يتم دمج الخلايا في مجال تشكيل الأطباق مع مثبط رو-كيناز وفي نسب معينة لإنتاج مجالات حجم استنساخه. بعد عدة أسابيع من الثقافة كمجالات عائمة، وأخيراً كوكولتوريس (الكويكبات) مقطوع ل immunostaining أو مطلي على صفائف مولتيليكترودي لقياس كثافة متشابك وقوتها. وبصفة عامة، فمن المتوقع أن هذا البروتوكول سوف تسفر عن المجالات العصبية 3D عرض علامات نوع الخلية الناضجة مقيدة، وتشكل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية ومعرض نشاط الشبكة متشابك عفوية الاندفاع. معا، يسمح هذا النظام فحص المخدرات والتحقيقات في آليات للمرض في نموذج أكثر ملاءمة بالمقارنة مع ثقافات أحادي الطبقة.

عند تنفيذها بشكل صحيح، هذا البروتوكول سوف تنتج معرفة السكان من كوكولتوريس الفنية أستروسيتيس28،،من3334 والخلايا العصبية35 المتولدة من هبسكس (الشكل 1A-1C)، كما مفصلة قبل26 وا?...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

في هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى وصف أسلوب استنساخه للجمع بين فصل البشرية pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية وأستروسيتيس معا في 3D المجال كوكولتوريس، الحفاظ على هذه المجالات في ظروف العائمة مجاناً، وفي وقت لاحق قياس نشاط الدائرة متشابك المجالات إيمونواناليسيس وتسجيلات مولتيليكترودي الصفيف.

النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...