Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Erik Ullian (UCSF) for intellektuelle bidrag til udformningen af disse procedurer, Dr. Michael Ward (NIH) for teknisk rådgivning om iNeuron differentiering, og Saba Barlas for foreløbige billedanalyse.

1. celle kultur og reagens
Bemærk: Protokoller i dette afsnit er skrevet i den rækkefølge som de vises i differentiering protokol (afsnit 2). Se Tabel af materialer til materialer og katalog numre.
<ol><li>
Forberede overtrukne plader til cellekultur.
	<ol>
<li>Fortynd ekstracellulære matrix (ECM) belægning løsning med DMEM/F12 medier til at forberede en 1 mg/mL stamopløsning. Alikvot fortyndet ECM lagerfører løsning til 30 koniske rør af 3 mL og u...

I denne protokol beskriver vi en systematisk metode til fremstilling af 3D kugler af neurale cocultures. Områderne består af astrocytter og neuroner, som er afledt uafhængigt af hPSCs. Dog ikke i fokus i denne protokol, generation af ren populationer af astrocytter fra hPSCs28 er et kritisk skridt og kan være en teknisk udfordring, hvis udføres uden forudgående erfaring. Dette første skridt i generation af disse synaptic mikrokredsløb bør udføres med minutiøse tidtagning og sans for det...

Astrocytter er en meget rigelige glial celletype inden for det centrale nervesystem (CNS) med en lang række funktionelle ansvar uden for strukturstøtte. Gennem udskillelsen af opløselige synaptogenic faktorer og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, astrocytter støtte i etableringen og klynger af modne synapser under udvikling1. De også spiller en afgørende rolle i at bevare sundhed og plasticitet i synapserne gennem ekstracellulære signaling2,3,4,5, og bidrage til stabilitet på lang sigt af homeostatiske miljøer ved at regulere ekstracellulære kalium samt glutamat og udskillelsen af energi substrater og ATP6,7,8. Endelig, de kan bidrage til neurotransmission ved at påvirke extrasynaptic strømninger9, og kan indirekte påvirke aktivitet gennem andre celletyper såsom fremme af myelination10. Vigtigere, fordi abnormitet eller dysfunktion af astrocytter kan føre til mange udviklingsforstyrrelser syndromer og voksen neuropatologiske, er der et indlysende behov for at medtage astrocytter sammen med neuroner i manipuleret neurale netværk i rækkefølge for en forbedret model af den endogene hjernen miljø. En integreret kendetegner astrocytter er deres evne til formen dynamisk samspil med neuronal synapser1,11,12. I mangel af glia danner neuroner et begrænset antal synapser, der generelt mangler også funktionelle modenhed13.
Menneskelige astrocytter vise morfologiske, transcriptional og funktionelle egenskaber — såsom øget størrelsen og kompleksiteten af forgrenede, samt artsspecifikke gener – der ikke er sammenfattet i gnavere12,14, 15. Som et resultat, studerer udnytte menneskelige pluripotente stamceller (hPSC)-afledte neurale celler har blive bredt accepteret som en mulighed for at undersøge CNS-relaterede sygdomme i vitro samtidig udvikle nye behandlingsformer, skade modeller og kultur paradigmer16 ,17. Derudover tillader hPSCs undersøgelse af menneskelige synapse dannelsen og funktionen uden behov for primære væv18,19.
En hindring for vores forståelse af, hvordan forskellige celletyper og signaler bidrage til synaptic kredsløb funktion er manglen på relevante modeller af den menneskelige hjerne. Der er behov for en passende platform til at sammenfatte sine synaptic netværk med high fidelity og reproducerbarhed. For nylig har interesse er opstået i produktion af 3D kultur systemer (bredt kendt som 'organoids,' 'spheroids' eller 'mini hjerner')20 model komplekse tredimensionale (3D) strukturer på cellulære og makro niveau. 3D kultur systemer bevarer ECM og celle-celle interaktioner, der er normalt fraværende eller begrænset under typiske 2D coculture paradigmer21,22. En overflod af teknikker findes for dyrkning 3D neurale spheroids23,24,25; men mange kræver langvarige kultur perioder (måneder til år) til spontan udvikling og lag bevarelse, med brugeren udviser meget lidt kontrol over output.
Her viser vi en systematisk metode til hurtigt og konsekvent bioengineer neurale interaktioner blandt flere celletyper (pre differentieret neuroner og astrocytter) afledt af hPSCs ved at samle celler i område cocultures ('asteroider')26 at sammenfatte menneske-specifikke morfologiske kompleksiteter i 3D. Denne high-density neurale systemet genererer jævnt spredt neurale undertyper, der tager på ældre ejendomme over tid og kan screenet eller analyseres i en høj overførselshastighed måde. Vi demonstrere for første gang at menneskelige astrocytter fremkalde synaptic netværksaktivitet brast i disse 3D cocultures. Derudover er denne protokol let at tilpasse til at generere områder af forskellige størrelser, til at udnytte cellerne angivet til forskellige regionale identiteter i CNS, og til at studere samspillet mellem flere andre celletyper som ønsket.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

En hindring for vores forståelse af, hvordan forskellige celletyper og signaler bidrage til synaptic kredsløb funktion er manglen på relevante modeller for at studere den menneskelige hjerne. En ny teknologi til at løse dette problem er brugen af tre-dimensionelle (3D) neurale cellekulturer, kaldes 'organoids' eller 'spheroids', for langsigtet præservering af intercellulære interaktioner herunder ekstracellulære adhæsionsmolekyler. Men systemerne kultur er tidskrævende og ikke systematisk genereret. Her, vi beskriver en metode til hurtigt og konsekvent producere 3D cocultures af neuroner og astrocytter fra humane pluripotente stamceller. Første, forhånd differentieret astrocytter og neuronal ophav er adskilt og tælles. Næste, celler i kugle-dannende kombineret retter med en Rho-Kinase inhibitor og på specifikke nøgletal til at producere kugler af reproducerbare størrelse. Efter flere ugers kultur som flydende kugler, er cocultures ('asteroider') Endelig sectioned for immunfarvning eller forgyldt ved multielectrode arrays til at måle synaptic tæthed og styrke. Generelt forventes det, at denne protokol vil give 3D neurale kugler, der vise modne celletype begrænset markører, danne funktionelle synapser og udstille spontan synaptic netværk burst aktivitet. Sammen, tillader dette system stof screening og undersøgelser mekanismer af sygdom i en mere velegnet model i forhold til éncellelag kulturer.

Når udført korrekt, vil denne protokol producere definerede populationer af funktionelle cocultures astrocytter28,33,34 og neuroner35 genereret fra hPSCs (figur 1A-1C), som detaljerede tidligere26 og beskrevet her i trin 2.1-2.2. Denne trinvis procedure, med brug af microwell plader, forventes at give...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

I denne protokol, vi har til formål at beskrive en reproducerbar metode til at kombinere dissocieres humane pluripotente stamceller afledt neuroner og astrocytter sammen i 3D sfære cocultures, vedligeholdelse af disse områder i frie flydende betingelser, og efterfølgende måle synaptic kredsløb aktivitet af kugler med immunoanalysis og multielectrode array optagelser.

Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentierende chondrocytter fra perifert blodafledte humane inducerede pluripotente stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserede omprogrammering af menneskelige primære fibroblaster til induceret pluripotente stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af 3D hud Organoid fra ledningen blod-afledte induceret pluripotente stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Forbigående behandling af humane pluripotente stamceller med DMSO for at fremme differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...