Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We zouden graag bedanken Dr. Erik Ullian (UCSF) voor intellectuele input over het ontwerp van deze procedures, Dr. Michael Ward (NIH) voor technisch advies over iNeuron differentiatie, en Saba Barlas voor voorlopige beeldanalyse.

1. cel cultuur en bereiding van het reagens
Opmerking: De protocollen in deze sectie zijn geschreven in de volgorde waarin ze worden weergegeven in het differentiatie-protocol (sectie 2). Zie de Tabel van materialen voor materialen en catalogus nummers.
<ol><li>
Gecoate platen voorbereiden celkweek.
	<ol>
<li>Verdun extracellulaire matrix (ECM) coating oplossing met DMEM/F12 media te bereiden een 1 mg/mL stockoplossing. Aliquot de verdunde ECM in 30 conische...

In dit protocol beschrijven we een systematische methode voor de productie van 3D bollen van neurale cocultures. De bollen zijn samengesteld uit astrocyten en neuronen, die onafhankelijk zijn afgeleid van hPSCs. Hoewel nog niet de focus van dit protocol, kan de generatie van pure populaties van astrocyten van hPSCs28 is een cruciale stap en technisch uitdagende indien dat gebeurt zonder voorafgaande ervaring. Deze eerste stap in de generatie van deze synaptic micro schakelingen moet worden uitgevo...

Astrocyten zijn een zeer overvloedige gliale celtype binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) met een scala aan functionele verantwoordelijkheden buiten structurele steun. Door middel van de secretie van oplosbare synaptogenic factoren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), astrocyten steun bij de oprichting en clustering van volwassen synapsen tijdens ontwikkeling1. Ze ook spelen een cruciale rol in het behoud van de gezondheid en de plasticiteit van synapsen t/m extracellulaire signalering2,3,4,5, en bijdragen aan de stabiliteit op lange termijn van homeostatische omgevingen door het reguleren van extracellulaire kalium en glutamaat, evenals de secretie van energie substraten en ATP6,7,8. Ten slotte, ze kunnen bijdragen tot de transmissie door het beïnvloeden van extrasynaptic stromingen9, en niet indirect invloed kunnen uitoefenen op de activiteit via andere celtypes zoals het bevorderen van myelinisering10. Belangrijker, omdat abnormaliteit of disfunctie van astrocyten tot veel neurologische syndromen en volwassen Neuropathologie leiden kan, is er een duidelijke behoefte aan het opnemen van astrocyten naast neuronen binnen gemanipuleerde neurale netwerken in volgorde voor een betere model van het endogene hersenen milieu. Een wezenlijk kenmerk van astrocyten is hun vermogen om de dynamische interacties vorm met neuronale synapsen1,11,12. Bij het ontbreken van glia vormen de neuronen een beperkt aantal synapsen, die in het algemeen ook functionele looptijd13 ontbreekt.
Menselijke astrocyten morfologische, transcriptionele en functionele kenmerken vertonen die — zoals toegenomen omvang en complexiteit van vertakkende, evenals soortspecifieke genen-dat zijn niet gerecapituleerd in knaagdieren12,14, 15. Dientengevolge, studies met behulp van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide neurale cellen hebben worden geaccepteerd als een middel van CNS-gerelateerde ziekten in vitro onderzoeken terwijl het ontwikkelen van nieuwe therapieën, letsel modellen en cultuur paradigma's16 ,17. Bovendien toestaan hPSCs de studie van menselijke synapse formatie en functioneren zonder de behoefte aan primaire weefsel18,19.
Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen van de menselijke hersenen. Er is behoefte aan een geschikt platform om te recapituleren zijn synaptic netwerken met hifi en reproduceerbaarheid. Onlangs, belang is gebleken bij de productie van 3D cultuur systemen (algemeen bekend als 'organoids,' 'spheroïden', of 'mini hersenen')20 tot complexe driedimensionale (3D) model structuren op mobiele en macro niveau. 3D cultuur systemen behouden ECM en cel-cel interacties die normaal afwezig of beperkt tijdens typische 2D coculture paradigma's21,22. Een overvloed aan technieken bestaan voor het kweken van 3D neurale spheroïden23,24,25; echter veel vereisen lange cultuur perioden (maanden tot jaren) voor spontane ontwikkeling en behoud van de laag, met de gebruiker vertonen zeer weinig controle over de output.
Hier, we illustreren een systematische methode om snel en consequent bioengineer Neurale interacties tussen meerdere celtypen (vooraf gedifferentieerde neuronen en astrocyten) afgeleid van hPSCs door het monteren van cellen in het gebied cocultures ('Asteroïden')26 die recapituleren mens-specifieke morfologische complexiteit van 3D. Gelijkmatig verspreide neurale subtypen dat volwassen eigenschappen overneemt na verloop van tijd en kunnen worden vertoond of vehiculumcontrolegroep in een high-throughput manier genereert deze high-density neurale systeem. We laten zien voor de eerste keer dat menselijke astrocyten synaptic netwerkactiviteit burst in deze 3D cocultures induceren. Dit protocol is bovendien gemakkelijk aan te passen voor het genereren van bollen van verschillende maten, te gebruiken van cellen die zijn opgegeven met verschillende regionale identiteiten van de CNS, en te bestuderen van interacties van meerdere andere celtypes zoals gewenst.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen voor het bestuderen van het menselijk brein. Een opkomende technologie om dit probleem te verhelpen is het gebruik van drie dimensionale (3D) neurale celculturen, betiteld als 'organoids' of 'spheroïden', voor de langetermijnbewaring van intercellulaire interacties met inbegrip van extracellulaire celadhesie-moleculen. Echter, deze cultuur-systemen zijn tijdrovend en niet systematisch gegenereerde. Hier, we detail een methode om snel en consistent produceren 3D cocultures van neuronen en astrocyten van menselijke pluripotente stamcellen. Eerste, vooraf gedifferentieerde astrocyten zijn neuronale voorlopercellen losgekoppeld en geteld. Vervolgens cellen worden gecombineerd in de bol-vormende gerechten met een Rho-Kinase inhibitor en op specifieke verhoudingen tot bollen van reproduceerbare grootte. Na verscheidene weken van cultuur als drijvende bollen, zijn cocultures ('Asteroïden') ten slotte gesegmenteerd voor immunokleuring of verguld op multielectrode arrays synaptic dichtheid en de sterkte te meten. In het algemeen verwacht wordt dat dit protocol 3D neurale bollen die volwassen cel-type beperkt markeringen weergeven, functionele synapsen vormen en spontane synaptic netwerkactiviteit barsten vertonen zal opleveren. Samen, toelaat dit systeem drug screening en onderzoek naar mechanismen van ziekte in een geschikter model ten opzichte van enkelgelaagde culturen.

Wanneer goed uitgevoerd, zal dit protocol omschreven populaties van functionele cocultures van astrocyten28,33,34 en neuronen35 gegenereerd op basis van hPSCs (figuur 1A-1C), produceren als gedetailleerde eerder26 en hier beschreven in stap 2.1-2.2. Deze stapsgewijze procedure, met het gebruik van micro...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Voorbijgaande behandeling van menselijke pluripotente stamcellen met DMSO om differentiatie te bevorderen

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...