Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Wir möchten danken Dr. Erik Ullian (UCSF) für geistigen Beitrag auf die Gestaltung dieser Verfahren, Dr. Michael Ward (NIH) für technische Beratung bezüglich iNeuron Differenzierung und Saba Barlas für vorläufige Bildanalyse.

(1) Zell-Kultur und Reagenz Vorbereitung
Hinweis: Die Protokolle in diesem Abschnitt sind in der Reihenfolge geschrieben, in denen sie in der Differenzierung-Protokoll (Abschnitt 2 erscheinen). Sehen Sie die Tabelle der Materialien für Materialien und Katalognummern.
<ol><li>
Zellkultur beschichtete Platten vorbereiten.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) Beschichtungslösung mit DMEM/F12 Medien 1 mg/mL Stammlösung vorbereiten. Aliquo...

In diesem Protokoll beschreiben wir eine systematische Methode zur Herstellung von 3D-Kugeln neuronale Kokulturen. Die Kugeln bestehen aus Astrozyten und Neuronen, die unabhängig von hPSCs abgeleitet werden. Obwohl nicht der Schwerpunkt dieses Protokolls, die Erzeugung von reinen Populationen von Astrozyten aus hPSCs28 ist ein entscheidender Schritt und technisch anspruchsvoll, wenn ohne Vorkenntnisse durchgeführt werden kann. Dieser erste Schritt bei der Erzeugung von diesen synaptischen Mikros...

Astrozyten sind ein sehr reichlich glialen Zelltyp innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) mit einer Vielzahl von funktionalen Aufgaben über strukturelle Unterstützung. Astrozyten Beihilfen durch Sekretion von löslichen Synaptogenic Faktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) bei der Schaffung und Bündelung von Reifen Synapsen während Entwicklung1. Sie auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und der Plastizität der Synapsen durch extrazelluläre Signal2,3,4,5, und tragen zur langfristigen Stabilität der homöostatischen Umgebungen durch Regulierung der extrazellulären Kalium sowie Glutamat und die Sekretion von Energie-Substrate und ATP6,7,8. Endlich, sie können dazu beitragen, Neurotransmission durch Beeinflussung der extrasynaptic Ströme9, und Aktivität durch andere Zelltypen wie die Förderung der Myelinisierung10indirekt beeinflussen können. Wichtig ist, weil zu viele Neurodevelopmental Syndrome und Erwachsenen Neuropathologie Anomalie oder Dysfunktion der Astrozyten führen kann, gibt es offensichtlich notwendig, damit eine verbesserte Astrozyten neben Neuronen innerhalb veränderter neuronaler Netze enthalten Modell der endogenen Gehirn Umwelt. Ein integraler Bestandteil Astrozyten ist ihre Fähigkeit, Form dynamischer Interaktion mit neuronalen Synapsen1,11,12. In Ermangelung der Glia bilden Neuronen eine begrenzte Anzahl von Synapsen, die in der Regel auch funktionale Reife13 fehlt.
Menschliche Astrozyten morphologischen, transkriptionelle und funktionellen Merkmale darstellen – wie zunehmende Größe und Komplexität der Verzweigung sowie artspezifische Gene –, sind nicht in Nagetieren12,14, rekapitulierte 15. Infolgedessen Studien unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete neuronalen Zellen werden akzeptiert als ein Mittel der CNS-Erkrankungen in-vitro- Prüfung, bei der Entwicklung neuartiger Therapien, Verletzungen Modelle und Kultur Paradigmen16 ,17. Darüber hinaus ermöglichen hPSCs die Studie der menschlichen Synapse Entstehung und Funktion ohne die Notwendigkeit für primäre Gewebe18,19.
Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen des menschlichen Gehirns. Besteht ein Bedarf für eine geeignete Plattform zu ihrer synaptischen Netzwerke mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu rekapitulieren. Vor kurzem, hat Interesse in der Produktion von 3D Culture Systeme entstanden (allgemein bekannt als "Organellen," "Sphäroide" oder "Mini-Köpfe")20 bis komplexe dreidimensionale (3D) Modell Strukturen auf der zellulären und Makroebene. 3D Culture-Systeme behalten ECM und Zell-Zell-Interaktionen, die normalerweise nicht vorhanden oder nur während der typischen 2D Coculture Paradigmen21,22. Eine Fülle von Techniken existieren für die Kultivierung 3D neuronale Sphäroide23,24,25; jedoch erfordern viele langwierige Kultur Zeiträume (Monate bis Jahre) für spontane Entwicklung und Erhaltung der Layer, mit dem Benutzer präsentiert sehr wenig Kontrolle über den Ausgang.
Hier zeigen wir eine systematische Methode, um schnell und konsequent Biotechnologe neuronalen Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen (Pre-differenzierten Neuronen und Astrozyten) abgeleitet von hPSCs durch den Zusammenbau von Zellen in Bereich Kokulturen ("Asteroiden")26 rekapitulieren, die Mensch-spezifische morphologische Komplexität in 3D. Dieses High-Density neuronalen System erzeugt gleichmäßig verteilten neuronalen Untertypen, die übernehmen ältere Eigenschaften im Laufe der Zeit und können gezeigt oder in gewissem Sinne Hochdurchsatz-untersucht. Wir zeigen erstmals, dass menschliche Astrozyten synaptischen Netzwerkaktivität platzen in dieser 3D Kokulturen induzieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll leicht anpassbar, Kugeln in verschiedenen Größen, um Zellen angegeben, um unterschiedlichen regionalen Identitäten des ZNS zu nutzen und Interaktionen von mehreren anderen Zelltypen wie gewünscht zu studieren zu generieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen für das Studium des menschlichen Gehirns. Eine neue Technologie zur Behebung dieses Problems ist die Verwendung von drei dreidimensionale (3D) neuronalen Zellkulturen, "Organellen" oder "Sphäroide", für die dauerhafte Erhaltung der interzelluläre Wechselwirkungen einschließlich extrazellulärer Adhäsionsmoleküle bezeichnet. Diese Systeme sind jedoch zeitaufwendig und nicht systematisch erzeugt. Hier wir ausführlich eine Methode, um schnell und konsequent produzieren 3D Kokulturen von Neuronen und Astrozyten aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Erste, bereits differenzierte Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen sind getrennt gezählt. Als nächstes werden Zellen im Bereich Bildung kombiniert Gerichte mit einem Rho-Kinase-Inhibitor und in bestimmten Verhältnissen Sphären reproduzierbare Größe produzieren. Nach mehreren Wochen der Kultur als schwimmende Kugeln sind Kokulturen ("Asteroiden") schließlich für Immunostaining geschnitten oder überzogen auf multielectrode Arrays, synaptische Dichte und Stärke zu messen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass dieses Protokoll neuronale 3D-Kugeln, die anzeigen Reife Zelltyp eingeschränkt Marker erzielt werden, funktionale Synapsen bilden und zeigen spontane synaptischen Netzwerkaktivität platzen. Dieses System ermöglicht zusammen, Drogen-Screening und Untersuchungen zu Mechanismen der Krankheit in einem geeigneteren Modell im Vergleich zu Monolayer-Kulturen.

Wenn Sie richtig durchgeführt wird, wird dieses Protokoll definierte Populationen von funktionalen Kokulturen Astrozyten28,33,34 und Neuronen35 aus hPSCs (Abbildung 1A-1C), erzeugt als produzieren. detaillierte zuvor26 und hier in Schritten 2.1-2.2 beschrieben. Dieses schrittweisen Verfahren, mit dem E...

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Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transiente Behandlung von humanen pluripotenten Stammzellen mit DMSO zur Förderung der Differenzierung

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...