Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות ד ר אריק Ullian (UCSF) עבור קלט רוחני על העיצוב של נהלים אלה, ד ר מייקל וורד (NIH) לקבלת ייעוץ טכני על בידול iNeuron, סבא Barlas לניתוח תמונה ראשונית.

1. תא תרבות והכנות ריאגנט
הערה: הפרוטוקולים בסעיף זה נכתבות לפי הסדר שבו הם מופיעים בפרוטוקול בידול (סעיף 2). ראה טבלה של חומרים עבור חומרים ואת מספרי קטלוג.
<ol><li>
להכין צלחות מצופה תרבית תאים.
	<ol>
<li>מטריצה חוץ-תאית (ECM) הפתרון ציפוי עם מדיה DMEM/F12 כדי להכין פתרו?...

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שיטתית לייצור של תלת-ממד תחומי cocultures עצבית. הספירות המורכבות האסטרוציטים, הנוירונים, אשר נגזרות hPSCs באופן עצמאי. אבל לא המוקד של פרוטוקול זה, הדור של אוכלוסיות טהור של האסטרוציטים מ hPSCs28 הוא שלב קריטי והוא יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית אם מבוצע ללא...

האסטרוציטים הם סוג תא גליה מאוד שופע בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם מגוון רחב של אחריות פונקציונלי מעבר תמיכה מבנית. באמצעות הפרשת synaptogenic מסיסים גורמי ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), האסטרוציטים לסייע הממסד ואישכול של הסינפסות בוגרת במהלך פיתוח1. הם גם לשחק תפקיד חיוני בשמירה על בריאותם של פלסטיות של הסינפסות דרך חוץ-תאית איתות2,3,4,5, ולתרום יציבות לטווח ארוך של homeostatic סביבות על ידי ויסות אשלגן חוץ-תאית, גלוטמט, כמו גם את הפרשת סובסטרטים אנרגיה ו- ATP6,7,8. לבסוף הם יכולים לתרום עצבית על ידי המשפיעים על זרמים extrasynaptic9, יכולים להשפיע בעקיפין בפעילות באמצעות סוגי תאים אחרים כגון קידום myelination10. חשוב, כי חריגות או תפקוד לקוי של האסטרוציטים יכול להוביל תסמונות התפתחותיות רבות neuropathology למבוגרים, יש צורך ברור כדי לכלול האסטרוציטים לצד נוירונים בתוך רשתות עצביות מהונדסים על מנת גרסה משופרת מודל של הסביבה אנדוגני במוח. מאפיין אינטגרלי של האסטרוציטים הוא היכולת שלהם טופס דינמי אינטראקציות עם הסינפסות עצביים1,11,12. בהיעדר עכשיו, דונלד, נוירונים בצורת מספר מוגבל של הסינפסות, אשר באופן כללי גם חוסר בגרות פונקציונלי13.
האסטרוציטים האנושי להציג מאפיינים מורפולוגיים, תעתיק ופונקציונליים — כגון הגדלת גודלו ומורכבותו של גנים מסעף, כמו גם תלויי מין – כי הם לא recapitulated מכרסמים12,14, 15. כתוצאה מכך, מחקרים ניצול תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC)-תאים עצביים נגזר יש להפוך לנפוץ כאמצעי בחינת מחלות הקשורות CNS במבחנה תוך פיתוח טיפולים חדשניים, פציעה מודלים, פרדיגמות לתרבות16 ,17. יתר על כן, hPSCs היתר חקר היווצרות האדם סינפסה ותפקוד ללא צורך רקמות ראשי18,19.
מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר רלוונטיות מודלים של המוח האנושי. יש צורך פלטפורמה המתאימה לסכם שלה רשתות סינפטית עם נאמנות גבוהה הפארמצבטית. לאחרונה, עניין התפתחה בייצור של מערכות התרבות תלת-ממד (בהרחבה המכונה 'organoids,' 'spheroids', או 'מיני המוח')20 לדגם מורכבים תלת מימדי (3D) מבנים ברמות הסלולר והדואר מאקרו. מערכות תלת-ממד תרבות שומרים על אינטראקציות ECM ו תאים-תאים הנמצאים בדרך כלל נעדר או מוגבלת במהלך coculture 2D אופייני פרדיגמות21,22. שפע של טכניקות קיימות עבור culturing23,spheroids עצבית 3D24,25; עם זאת, רבים מחייבים תקופות ממושכות תרבות (חודשים עד שנים) עבור שכבת שימור ופיתוח ספונטנית, עם המשתמש מפגין שליטה מעט מאוד על הפלט.
. כאן, להמחיש לנו שיטה שיטתית כדי במהירות, באופן עקבי bioengineer עצבית אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים (הנוירונים הבדיל מראש, האסטרוציטים) נגזר hPSCs על ידי הרכבת תאים לתוך כדור cocultures ("אסטרואידים")26 זה מסכם את הדברים המורכבות המורפולוגית אדם ספציפי ב- 3D. מערכת עצבית בצפיפות גבוהה זו יוצרת באופן שווה התפזרו עצבית יחוברו להשתלט על מאפייני בוגרת זמן, יכול להיות מוקרן או לבדיקה באופן תפוקה גבוהה. נדגים בפעם הראשונה האסטרוציטים האנושי זירוז פעילות רשת סינפטית פרץ באלה cocultures תלת-ממד. בנוסף, פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות ליצור כדורים בגדלים שונים, כדי לנצל את התאים שצוינו כדי זהויות אזוריות שונות של מערכת העצבים, וכדי ללמוד אינטראקציות של מספר סוגי תאים אחרים לפי הצורך.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר דגמים הרלוונטיים עבור הלומדים המוח האנושי. טכנולוגיות מתפתחות אחד כדי לטפל בבעיה זו הוא השימוש של שלוש התרבויות תאי העצבים (3D) תלת-ממדי, הנקרא 'organoids' או 'spheroids', לשם שימור לטווח ארוך של אינטראקציות המערכת כולל מולקולות אדהזיה חוץ-תאית. עם זאת, מערכות התרבות אלו הן זמן רב לא באופן שיטתי שנוצר. כאן, אנחנו פירוט שיטה לייצר במהירות ובאופן עקבי cocultures 3D של נוירונים, תאי גזע האסטרוציטים מ pluripotent אנושי. האסטרוציטים הראשון, הבדיל מראש, אבות עצביים הפומבית, ספרתי. בשלב הבא, תאים משולבים ב ויוצרים כדור מנות עם מעכב Rho-קינאז ועל יחסי מסוים כדי לייצר כדורים בגודל לשחזור. לאחר מספר שבועות של תרבות כמו כדורים צפים, cocultures ("אסטרואידים") סוף סוף למחלקה עבור immunostaining או מצופה על מערכים multielectrode למדידת צפיפות סינפטית וכוח. באופן כללי, הוא צפוי כי פרוטוקול זה תניב הספירות עצבית תלת-ממד להציג סמנים מסוג תאים בוגרים מוגבלים, יוצרות הסינפסות פונקציונלי ולאחר להפגין פעילות פרץ ספונטני רשת סינפטית. יחד, מערכת זו מאפשרת והתרופות הקרנה חקירות מנגנונים של המחלה במודל מתאים יותר לעומת תרבויות חד שכבתי.

כאשר מבוצעת כהלכה, פרוטוקול זה יפיק אוכלוסיות מוגדרות של cocultures תפקודית של האסטרוציטים28,33,34 / נוירונים35 המופקים hPSCs (איור 1 א'-1C), כמו מפורט בעבר26 , המתוארים כאן בשלבים 2.1 –...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...