Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

हम इन प्रक्रियाओं के डिजाइन पर बौद्धिक इनपुट के लिए डॉ एरिक Ullian (UCSF) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ माइकल वार्ड (NIH) iNeuron भेदभाव पर तकनीकी सलाह के लिए, और साबा बरलास प्रारंभिक छवि विश्लेषण के लिए ।

1. सेल संस्कृति और एजेंट की तैयारी
नोट: इस अनुभाग में प्रोटोकॉल में वे भिंनता प्रोटोकॉल (खंड 2) में प्रकट होने के क्रम में लिखे गए हैं । सामग्री और कैटलॉग संख्या के लिए सामग्री की तालिका दे?...

इस प्रोटोकॉल में, हम तंत्रिका cocultures के 3 डी क्षेत्रों के उत्पादन के लिए एक व्यवस्थित विधि का वर्णन । क्षेत्रों astrocytes और न्यूरॉन्स, जो स्वतंत्र रूप से hPSCs से प्राप्त कर रहे हैं से बना रहे हैं. हालांकि इस प्रोटो?...

Astrocytes संरचनात्मक समर्थन से परे कार्यात्मक जिंमेदारियों की एक किस्म के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में glial कोशिका प्रकार हैं । घुलनशील synaptogenic कारकों और extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों के स्राव के माध्यम से, astrocytes स्थापना में सहायता और परिपक्व synapses के विकास के दौरान clustering1. उंहोंने यह भी extracellular संकेतन2,3,4,5के माध्यम से synapses के स्वास्थ्य और प्लास्टिक की व्यवस्था को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और समस्थिति की दीर्घकालिक स्थिरता के लिए योगदान extracellular पोटेशियम और ग्लूटामेट को विनियमित करके वातावरण, साथ ही ऊर्जा सब्सट्रेट और एटीपी6,7,8का स्राव । अंत में, वे extrasynaptic धाराओं9को प्रभावित करने के द्वारा neurotransmission के लिए योगदान कर सकते हैं, और अप्रत्यक्ष रूप से myelination10को बढ़ावा देने के रूप में अन्य सेल प्रकार के माध्यम से गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात, क्योंकि विषमता या astrocytes की शिथिलता कई neurodevelopmental सिंड्रोम और वयस्क neuropathology के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वहां एक स्पष्ट करने के लिए इंजीनियर के भीतर न्यूरॉन्स के साथ astrocytes शामिल करने की जरूरत है तंत्रिका नेटवर्क के लिए आदेश में एक बेहतर अंतर्जात मस्तिष्क पर्यावरण के मॉडल । astrocytes की एक अभिंन विशेषता के लिए अपने ंयूरॉंस synapses1,11,12के साथ गतिशील बातचीत के फार्म की क्षमता है । glia के अभाव में, न्यूरॉन्स synapses की एक सीमित संख्या है, जो सामान्य रूप में भी कार्यात्मक परिपक्वता13कमी के रूप में.
मानव astrocytes प्रदर्शन रूपात्मक, transcriptional, और कार्यात्मक विशेषताओं-जैसे वृद्धि हुई आकार और शाखाओं में जटिलता के रूप में अच्छी तरह से प्रजातियों के रूप में विशेष जीन है कि कुतर12,14, में recapitulated नहीं कर रहे हैं, 15. नतीजतन, अध्ययन मानव pluripotent स्टेम सेल का उपयोग (hPSC)-तंत्रिका कोशिकाओं व्युत्पंन हो व्यापक रूप से सीएनएस में संबंधित रोगों की जांच के एक साधन के रूप में स्वीकार किए जाते है जबकि उपंयास उपचार, चोट मॉडल, और संस्कृति मानदंड16 विकसित ,17. इसके अलावा, hPSCs प्राथमिक ऊतक18,19के लिए की आवश्यकता के बिना मानव synapse गठन और समारोह के अध्ययन की अनुमति ।
कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क के प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । उच्च निष्ठा और reproducibility के साथ अपने synaptic नेटवर्क दोहराऊंगा करने के लिए एक उपयुक्त मंच की आवश्यकता है । हाल ही में, ब्याज 3 डी संस्कृति प्रणालियों के उत्पादन में उभरा है (मोटे तौर पर ' के रूप में जाना जाता organoids, ' ' spheroids, ' या ' मिनी दिमाग ')20 से मॉडल परिसर में तीन आयामी (3d) संरचनाओं सेलुलर और स्थूल स्तर पर । 3 डी संस्कृति प्रणालियों ECM और सेल सेल बातचीत है कि सामांय रूप से अनुपस्थित या ठेठ 2d coculture मानदंड21,22के दौरान सीमित है बनाए रखने के । तकनीक का एक बहुतायत संवर्धन 3 डी तंत्रिका spheroids23,24,25के लिए मौजूद; हालांकि, कई लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है (महीने साल के लिए) सहज विकास और परत संरक्षण के लिए, उत्पादन पर बहुत कम नियंत्रण प्रदर्शन उपयोगकर्ता के साथ ।
यहां, हम तेजी से और लगातार इंजन के लिए एक व्यवस्थित विधि वर्णन एकाधिक कोशिका प्रकार के बीच तंत्रिका बातचीत (पूर्व विभेदित न्यूरॉन्स और astrocytes) hPSCs से व्युत्पंन में कोशिकाओं द्वारा कोडांतरण क्षेत्र cocultures (' क्षुद्रग्रहों ')26 कि 3 डी में मानव विशिष्ट रूपात्मक जटिलताओं दोहराऊंगा । इस उच्च घनत्व तंत्रिका प्रणाली समान रूप से फैलाया तंत्रिका उपप्रकार है कि समय के साथ परिपक्व संपत्तियों पर ले और जांच की जा सकती है या एक उच्च प्रवाह तरीके से परख उत्पंन करता है । हम पहली बार है कि मानव astrocytes इन 3 डी cocultures में synaptic नेटवर्क फट गतिविधि प्रेरित के लिए प्रदर्शित करते हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से विभिंन आकारों के क्षेत्रों उत्पंन करने के लिए अनुकूलनीय है, सीएनएस के विभिंन क्षेत्रीय पहचान करने के लिए निर्दिष्ट कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, और कई अंय प्रकार के सेल के संपर्क का अध्ययन करने के लिए वांछित के रूप में ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए तीन आयामी (3 डी) तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों का उपयोग है, ' organoids ' या ' spheroids ', extracellular आसंजन अणुओं सहित सेलुलर बातचीत के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए । हालांकि, इन संस्कृति प्रणालियों समय लेने और व्यवस्थित नहीं उत्पंन कर रहे हैं । यहां, हम विस्तार से एक तरीका तेजी से और लगातार मानव pluripotent स्टेम सेल से ंयूरॉंस और astrocytes के 3 डी cocultures का उत्पादन । पहले, पूर्व विभेदित astrocytes और न्यूरॉन progenitors असंबद्ध और गिना जाता है । अगले, कोशिकाओं के क्षेत्र में संयुक्त कर रहे है एक Rho-कळेनासे अवरोध करनेवाला और विशिष्ट अनुपात में reproducible आकार के क्षेत्रों के उत्पादन के साथ व्यंजन बनाने । चल क्षेत्रों के रूप में संस्कृति के कई हफ्तों के बाद, cocultures (' क्षुद्रग्रहों ') अंत में immunostaining के लिए खोदी या multielectrode arrays पर चढ़ाया synaptic घनत्व और शक्ति को मापने के लिए कर रहे हैं । सामांय में, यह उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों है कि परिपक्व सेल प्रकार प्रतिबंधित मार्करों प्रदर्शन उपज, कार्यात्मक synapses फार्म का, और प्रदर्शन सहज synaptic नेटवर्क फट गतिविधि होगा । एक साथ, इस प्रणाली monolayer संस्कृतियों की तुलना में एक अधिक उपयुक्त मॉडल में रोग के तंत्र में दवा जांच और जांच परमिट ।

जब ठीक से प्रदर्शन किया, इस प्रोटोकॉल astrocytes28,३३,३४ और hPSCs से उत्पंन३५ न्यूरॉन्स के कार्यात्मक cocultures की आबादी परिभाषित उत्पादन होगा (आंकड़ा 1a</...

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Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

इस प्रोटोकॉल में, हम असंबद्ध मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पंन ंयूरॉंस और 3 डी क्षेत्र cocultures में एक साथ astrocytes, मुक्त अस्थाई स्थितियों में इन क्षेत्रों को बनाए रखने के संयोजन के लिए एक reproducible विधि का वर्णन है, और बाद में immunoanalysis और multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग के साथ क्षेत्रों के synaptic सर्किट गतिविधि को मापने.

मानव Pluripotent स्टेम सेल से Astrocytes और न्यूरॉन्स की 3डी Cocultures के साथ Synaptic Microcircuit मॉडलिंग

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

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