Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

우리는 박사 마이클 워드 (NIH)에 대 한 기술적인 조언 iNeuron 차별화, 그리고 사바 Barlas 예비 이미지 분석에 대 한 이러한 절차의 디자인에 지적 입력을 위한 박사 에릭 Ullian (UCSF)를 감사 하 고 싶습니다.

1. 세포 문화 및 시 약 준비
참고:이 섹션에서는 프로토콜은 분화 프로토콜 (제 2)에 표시 되는 순서에 따라 작성 됩니다. 재료와 카탈로그 번호에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>
세포 배양에 대 한 코팅된 접시를 준비 합니다.
	<ol>
<li>세포 외 기질 (ECM) 코팅 솔루션 DMEM/F12 미디어 준비 1 mg/mL 재고 솔루션을 희석. Aliquot 희석된 ECM 솔루션 ...

이 프로토콜에서 우리는 신경 cocultures의 3D 분야의 생산을 위한 체계적인 방법을 설명합니다. 분야 이다와는 독립적으로 파생 hPSCs에서 뉴런으로 구성 됩니다. 비록 하지이 프로토콜의 초점, 이다 hPSCs28 에서 순수한 인구의 세대는 중요 한 단계 이며 사전 경험 없이 수행 하는 경우에 기술적으로 도전적 일 수 있다. 이러한 시 냅 스 칩의 세대에서이 첫 번째 단계는 세심 한 타이밍 ...

이다는 구조 지원 이상 기능적인 책임의 다양 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 매우 풍부한 glial 세포 유형입니다. 수용 성 synaptogenic 요인의 세포 외 기질 (ECM) 분 비를 통해 이다 설립 및 개발1동안 성숙한 시 냅 스의 클러스터링에 도움이. 그들은 또한 건강과 extracellular 신호2,3,,45, 시 냅 스의가 소성 유지에 중요 한 역할을 하 고 항상성의 장기 안정성을 세포 외 칼륨과 조미료, 뿐만 아니라 에너지 기질과 ATP6,,78의 분 비를 조절 하 여 환경. 마지막으로, 그들은9, extrasynaptic 전류 영향을 미치는 의해 neurotransmission에 기여할 수 있는 고 수 직접 다른 세포 유형 myelination10홍보 등을 통해 활동 영향. 중요 한 것은, 비정상적인 또는 이다의 부전 이어질 수 많은 neurodevelopmental 증후군 성인 neuropathology, 이므로 개선에 대 한 순서로 함께 설계 된 신경망에서 뉴런 이다를 포함 하는 명백한 필요가 내 생 두뇌 환경 모델입니다. 이다의 필수적인 특성 신경 시 냅 스1,,1112양식 동적 상호 작용을 그들의 능력입니다. 명과의 부재에서 신경 시 냅 스, 일반적으로 또한 기능 성숙13부족의 제한 된 수를 형성 한다.
인간의 이다 표시, transcriptional, 형태학 및 기능적 특성-분기, 뿐만 아니라 종의 유전자의 증가 크기와 복잡성 등-는 설치류12,14에 지 하지는 15. 그 결과, 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC)를 활용 하 여 연구-파생된 신경 세포 소설 치료, 부상, 모델과 문화 패러다임16 개발 하는 동안 생체 외에서 CNS 관련 질병 검사의 수단으로 널리 수용 되는 ,17. 또한, hPSCs 인간 시 냅 스 형성 및 기본 조직18,19에 대 한 필요 없이 기능 연구를 허용합니다.
시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간 두뇌의 관련 모델의 부족 이다. 높은 정확도와 재현성의 시 냅 스 네트워크를 정리 하는 적절 한 플랫폼에 대 한 필요가 있다. 최근, 관심 3D 문화 시스템의 생산에서 나왔다 ('organoids,'로 널리 알려진 'spheroids,' 또는 '미니 두뇌') 휴대 및 매크로 수준에서 구조 하는 복잡 한 3 차원 (3D)를20 . 3D 문화 시스템은 일반적으로 결 석 하 또는 제한 된 일반적인 2D coculture 패러다임21,22동안 ECM 및 셀 상호 작용을 유지 합니다. 기술의 풍부한 3D 신경 spheroids23,,2425; 경작에 대 한 존재 그러나, 많은 긴 문화 기간 필요 (년 개월) 자연 개발 및 레이어 보존, 사용자 아주 작은 제어할 출력 전시.
여기, 우리가 설명 하는 체계적인 방법을 빠르게 하 고 지속적으로 여러 세포 유형 (사전 차별화 된 뉴런을 이다) 간의 bioengineer 신경 상호 작용 영역 cocultures ('소행성')26으로 셀을 조립 하 여 hPSCs에서 파생 된 는 정리 차원에서 인간의 특정 형태학 복잡. 이 고밀도 신경 시스템 균등 하 게 분산 된 신경 하위 시간이 지남에 성숙한 속성에 걸릴 하 고 상영 하거나 높은 처리량 방식에서 분석을 생성 합니다. 처음으로 인간의 이다 이러한 3D cocultures에서 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 유도 대 한 설명 합니다. 또한,이 프로토콜은 다른 크기, CNS의 다른 지역 id에 지정 된 셀을 사용 하 고 여러 다른 종류의 세포로 원하는 상호 작용을 공부 하는 분야를 생성에 쉽게 적응.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간의 뇌 연구 관련 모델의 부족 이다. 이 문제를 해결 하려면 한 신흥 기술을 3 차원 (3D) 신경 세포 배양, 'organoids' 또는 'spheroids', extracellular 접착 분자를 포함 하 여 세포 상호 작용의 장기 보존에 대 한 나의 사용 이다. 그러나, 이러한 문화 시스템은 시간 소모 하 고 체계적으로 생성 된. 여기, 우리 신속 하 고 지속적으로 신경의 3D cocultures을 생산 하는 방법에 자세히 설명 하 고 인간 만능에서 이다 줄기 세포. 첫째, 미리 차별화 이다 신경 창시자는 해리와 계산. 다음으로, 셀 영역을 형성 결합 되어 요리로 키 니 아 제 억제제와 재현 크기의 구체를 생산 하는 특정 비율에. 몇 주 후 문화의 부동 구체로, cocultures ('소행성') 마지막으로 immunostaining에 대 한 구분 또는 시 냅 스 밀도 강도 측정 하는 multielectrode 배열에 따라 도금. 일반적으로,이 프로토콜 표시 성숙한 세포 유형 제한 표식, 기능 시 냅 스를 형성 하 고는 자발적 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 전시 3D 신경 분야를 얻을 것입니다 예상 된다. 함께,이 시스템 단층 문화에 비해 더 적합 한 모델에서 약물 검사와 질병의 메커니즘에 대 한 조사를 허용 합니다.

제대로 수행 하는 경우이 프로토콜으로 이다28,33,34 와 뉴런35 (그림 1A-1C), hPSCs에서 생성 된 기능 cocultures의 정의 된 인구를 생산할 예정 이다 26 이전 상세 하 고 여기에 설명 된 단계 2.1-2.2. 이 단계적 절차, microwell 접시를 사용 하 여...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

분화를 촉진하기 위해 DMSO를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 일시적인 치료

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...