Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Erik Ullian (UCSF) for intellektuell inndata på utformingen av disse prosedyrene, Dr. Michael Ward (NIH) for tekniske råd om iNeuron differensiering og Saba Barlas for foreløpige bildeanalyser.

1. celle kultur og forberedelse av reagenser
Merk: Protokollene i denne delen er skrevet i rekkefølgen de vises i differensiering protokollen (inndeling 2). Se Tabellen for materiale for materialer og katalogfilene tall.
<ol><li>
Forberede belagt plater cellekultur.
	<ol>
<li>Fortynne ekstracellulær matrix (EFM) belegg løsning med DMEM/F12 media å forberede en 1 mg/mL lagerløsning. Aliquot utvannet ECM lagerløsning inn 30 konisk rørene 3 ml og umiddel...

I denne protokollen beskriver vi en systematisk metode for produksjon av 3D Sfærer av nevrale cocultures. Kulene er sammensatt av astrocyttene og neurons, som er avledet uavhengig fra hPSCs. Om ikke fokusere denne protokollen, generering av ren bestander av astrocyttene fra hPSCs28 er et kritisk punkt og kan være teknisk utfordrende hvis utført uten tidligere erfaring. Dette første trinnet i generasjon av disse synaptic microcircuits skal utføres med grundig timing og oppmerksomhet på detalj...

Astrocyttene er en svært rikt glial celle type i sentralnervesystemet (CNS) med en rekke funksjonelle ansvar utover strukturell støtte. Gjennom sekresjon av løselig synaptogenic faktorer og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, astrocyttene hjelp i etableringen og klynger av modne synapser under utvikling1. De også spille en avgjørende rolle i å opprettholde helse og plastisitet av synapser gjennom ekstracellulære signalnettverk2,3,4,5, og bidra til langsiktig stabilitet av homøostatisk miljøer ved å regulere ekstracellulære kalium og glutamat, samt utskillelsen av energi underlag og ATP6,7,8. Til slutt, de kan bidra til neurotransmission ved å påvirke extrasynaptic strøm9og kan indirekte påvirke aktivitet gjennom andre celletyper som fremmer myelination10. Viktigst, fordi unormalt eller dysfunksjon av astrocyttene kan føre til mange neurodevelopmental syndromer og voksen neuropathology, er det et åpenbart behov inkludere astrocyttene sammen med nevroner i utvikling neural nettverk for at en forbedret modell av endogene hjernen miljøet. En integrert karakteristisk for astrocyttene er deres evne til skjemaet dynamisk interaksjoner med neuronal synapser1,11,12. I fravær av glia danne nerveceller et begrenset antall synapser, som generelt mangler også funksjonelle modenhet13.
Menneskelige astrocyttene vise morfologiske, transcriptional og funksjonelle egenskaper-som økt størrelsen og kompleksiteten av forgrening, samt artsspesifikke gener-det er ikke recapitulated i Red12,14, 15. Resultatet studier utnytte menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede neural celler har blitt allment akseptert som et middel til å undersøke CNS-relaterte sykdommer i vitro samtidig utvikle romanen terapi, skader modeller og kultur paradigmer16 ,17. Videre at hPSCs studiet av menneskelig synapse dannes og funksjon uten behov for primære vev18,19.
En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på relevante modeller av den menneskelige hjernen. Det er behov for en passende plattform å recapitulate synaptic klyngeutvikling med Hi-Fi og reproduserbarhet. Nylig interesse har dukket opp i produksjonen av 3D kultur systemer (bredt kjent som 'organoids', 'spheroids' eller 'mini hjerner')20 modell komplekse tredimensjonale (3D) strukturer på mobilnettet og makro. 3D kultur systemer beholder ECM og celle-celle interaksjoner som normalt fraværende eller begrenset i typisk 2D coculture paradigmer21,22. Det finnes en rekke teknikker for dyrking 3D nevrale spheroids23,24,25; men mange krever lengre kultur perioder (måneder til år) for spontane utvikling og lag bevaring, med brukeren viser svært liten kontroll over resultatet.
Her vi illustrerer en systematisk metode for å raskt og konsekvent bioengineer nevrale interaksjon mellom flere celletyper (pre differensiert nevroner og astrocyttene) avledet fra hPSCs ved å sette sammen cellene i området cocultures ("asteroider")26 som recapitulate menneske-spesifikke morfologiske kompleksiteten i 3D. Høy tetthet nevrale systemet genererer jevnt spredt nevrale undertypene som ta på eldre egenskaper over tid og kan vist eller assayed på en høy gjennomstrømming måte. Vi viser for første gang at menneskelige astrocyttene induserer synaptiske nettverksaktivitet brast i disse 3D cocultures. I tillegg er denne protokollen lett tilpasses generere sfærer av forskjellige størrelser, utnytte celler angitt for ulike regionale identiteten til CNS og studere interaksjoner av flere andre celletyper som ønsket.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på aktuelle modeller for å studere den menneskelige hjernen. En ny teknologi som løser dette problemet er bruk av tre-dimensjonale (3D) nevrale cellekulturer, kalt 'organoids' eller 'spheroids', for langsiktig bevaring av intercellulære interaksjoner inkludert ekstracellulære vedheft molekyler. Disse kultur systemene er imidlertid tidkrevende og ikke systematisk generert. Her vi detalj en metode for å raskt og konsekvent produserer 3D cocultures av neurons og astrocyttene fra menneskelige pluripotent stamceller. Første, pre differensiert astrocyttene neuronal progenitors avstand og telt. Deretter celler kombineres i sfæren-forming retter med en Rho-Kinase inhibitor og spesifikke formater å produsere sfærer av reproduserbar størrelse. Etter flere uker med kultur som flytende sfærer, er cocultures ("asteroider") delt for immunostaining eller belagt på multielectrode matriser for å måle synaptic tetthet og styrke. Generelt er det forventet at denne protokollen vil gi 3D nevrale sfærer som vise eldre celle-type begrenset markører, danne funksjonelle synapser og utstillingen spontan synaptic burst nettverksaktivitet. Sammen tillater dette systemet narkotikarelaterte screening og etterforskning mekanismer av sykdom i en mer passende modell sammenlignet monolayer kulturer.

Når utført riktig, vil denne protokollen produsere definerte bestander av funksjonelle cocultures astrocyttene28,33,34 og neurons35 generert fra hPSCs (figur 1A-1C), som detaljert tidligere26 og beskrevet her i trinn 2.1-2.2. Dette trinnvis prosedyre, med bruk av microwell plater, forventes å gi 3D n...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

I denne protokollen, vi tar sikte på å beskrive en reproduserbar metode for å kombinere dissosiert menneskelige pluripotent stilk cellen avledet nevroner og astrocyttene sammen i 3D sphere cocultures, opprettholde disse kuler i gratis flytende forhold, og senere måle synaptic krets aktivitet av kulene med immunoanalysis og multielectrode matrise innspillinger.

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserte omprogrammering av menneskelig primære fibroblaster til indusert Pluripotent stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon 3D huden Organoid fra ledningen blod-avledet indusert Pluripotent stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...