Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual sobre o design desses procedimentos, Dr. Michael Ward (NIH) para aconselhamento técnico na diferenciação de iNeuron e Saba Barlas para análise preliminar de imagens Dr. Erik Uliano (UCSF).

1. celular cultura e preparação dos reagentes
Nota: Os protocolos nesta seção são escritos na ordem em que aparecem no protocolo de diferenciação (secção 2). Consulte a Tabela de materiais para materiais e números de catálogo.
<ol><li>
Prepare placas revestidas para cultura de células.
	<ol>
<li>Dilua a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) com DMEM/F12 mídia para preparar um 1 mg/mL solução. Alíquota o ECM diluído solução...

Neste protocolo, descrevemos um método sistemático para a produção de esferas 3D de cocultures neurais. As esferas são compostas de astrócitos e neurônios, que são derivados independentemente de hPSCs. Embora não o foco do presente protocolo, a geração das populações puras de astrócitos de hPSCs28 é uma etapa crítica e pode ser tecnicamente desafiador se realizada sem experiência prévia. Este primeiro passo na geração destes microcircuitos sinápticos deve ser realizado com sin...

Astrócitos são um tipo de célula glial altamente abundante no sistema nervoso central (SNC) com uma variedade de responsabilidades funcionais, além de suporte estrutural. Através da secreção de fatores solúveis synaptogenic e componentes da matriz extracelular (ECM), astrócitos ajudar no estabelecimento e clustering de sinapses maduras durante desenvolvimento1. Eles também desempenham um papel fundamental na manutenção da saúde e da plasticidade de sinapses a extracelular sinalização2,3,4,5e contribuam para a estabilidade a longo prazo de homeostático ambientes regulando o potássio extracelular e glutamato, bem como a secreção de substratos de energia e ATP6,7,8. Finalmente, eles podem contribuir para a neurotransmissão, influenciando as correntes extrasynaptic9e indiretamente podem influenciar a atividade através de outros tipos de células, tais como a promoção de mielinização10. Importante, porque a anomalia ou disfunção de astrócitos pode levar a muitas síndromes de desenvolvimento neurológico e neuropatologia adulta, há uma necessidade óbvia de incluem astrócitos ao lado de neurônios dentro engenharia redes neurais em ordem para uma melhoria modelo do ambiente endógeno do cérebro. Uma característica integral de astrócitos é sua capacidade de interações dinâmicas de forma com sinapses neuronais1,11,12. Na ausência da glia, os neurônios formam um número limitado de sinapses, que em geral também falta maturidade funcional13.
Astrócitos humanos apresentam características morfológicas, transcriptional e funcionais — tais como o aumento do tamanho e complexidade de ramificação, bem como espécie-específicos de genes — que não são recapitulada em roedores12,14, 15. Como resultado, estudos utilizando células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-células neurais derivadas tornam-se amplamente aceito como um meio de examinar doenças relacionadas com a CNS em vitro durante o desenvolvimento de novas terapias, lesão modelos e paradigmas de cultura16 ,17. Além disso, o hPSCs permite o estudo da formação humana sinapse e função sem a necessidade de tecido primário18,19.
Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes do cérebro humano. Há uma necessidade de uma plataforma adequada recapitular suas redes sinápticas com alta fidelidade e reprodutibilidade. Recentemente, o interesse surgiu na produção de sistemas de cultura 3D (amplamente conhecido como 'organoids', 'esferoides', ou 'mini cérebro')20 para modelar complexo tridimensional (3D) estruturas a nível celular e macro. Sistemas de cultura 3D retém ECM e célula-célula de interações que são normalmente ausente ou limitado durante coculture 2D típico paradigmas21,22. Uma abundância de técnicas existem para cultivo esferoides neural 3D23,24,25; no entanto, muitos exigem períodos longos de cultura (meses a anos) para o desenvolvimento espontâneo e preservação de camada, com o usuário, exibindo muito pouco controle sobre a saída.
Aqui, podemos ilustrar um método sistemático para rapidamente e consistentemente bioengineer neural interações entre vários tipos de células (neurônios pre-diferenciados e astrócitos) derivado de hPSCs pela montagem de células em cocultures de esfera (asteroides)26 que recapitular humanos específicas complexidades morfológicas em 3D. Este sistema neural de alta densidade gera uniformemente dispersa os subtipos neurais que assumir Propriedades maduras ao longo do tempo e podem ser exibidos ou analisados de uma forma de alta produtividade. Demonstramos pela primeira vez que humano astrócitos induzem atividade de explosão rede sináptica nestas cocultures 3D. Além disso, este protocolo é facilmente adaptável para gerar esferas de tamanhos diferentes, utilizam células especificadas para diferentes identidades regionais do SNC e estudar as interações de vários outros tipos de células, como desejado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes para o estudo do cérebro humano. Uma tecnologia emergente para abordar esta questão é o uso de três dimensões (3D) neural as culturas celulares, denominado 'organoids' ou 'esferoides', para a preservação de longo prazo das interações intercelulares incluindo moléculas de adesão extracelular. No entanto, estes sistemas de cultura são demoradas e não sistematicamente gerado. Aqui, detalhamos um método rapidamente e consistentemente produzir cocultures 3D dos neurônios e células-tronco astrócitos de pluripotentes humanas. Primeiros, pre-diferenciados astrócitos progenitores neuronais dissociadas e estão contados. Em seguida, as células são combinadas em esfera-formando pratos com um inibidor de Rho-quinase e em proporções específicas para produzir esferas de tamanho reprodutível. Após várias semanas de cultura como esferas flutuantes, cocultures ('asteroides') são finalmente seccionados por imunocoloração ou chapeados sobre matrizes multielectrode para medir a força e a densidade sináptica. Em geral, espera-se que este protocolo vai render 3D esferas neurais que exibir os marcadores de célula madura-tipo restringido, formam sinapses funcionais e apresentam atividade de explosão espontânea rede sináptica. Juntos, este sistema permite rastreio de drogas e investigações sobre os mecanismos da doença em um modelo mais adequado, em comparação com as culturas monocamada.

Quando executado corretamente, este protocolo irá produzir populações definidas de cocultures funcionais de astrócitos28,33,34 e neurônios35 gerados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detalhados anteriormente26 e aqui descrito em passos 2.1 – 2.2. Este procedimento passo a passo, com o uso de...

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Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Biologia do Desenvolvimento

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...