Name: synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi vill tacka Dr Erik Ullian (UCSF) för intellektuell ingång på utformningen av dessa förfaranden, Dr Michael Ward (NIH) för teknisk rådgivning om iNeuron differentiering och Saba Barlas för preliminära bildanalys.

1. cell kultur och REAGENSBEREDNING
Obs: Protokollen i detta avsnitt är skrivna i den ordning som de visas i protokollet differentiering (avsnitt 2). Se Tabell för material för material och katalognummer.
<ol><li>
Förbereda plattorna för cellodling.
	<ol>
<li>Späd extracellulär matrix (ECM) beläggning lösningen med DMEM/F12 media att förbereda en 1 mg/mL stamlösning. Alikvotens utspädda ECM stamlösning till 30 koniska rör 3 mL varje och omedelb...

I detta protokoll beskriver vi en systematisk metod för produktion av 3D sfärer av neurala cocultures. Sfärernas består av astrocyter och nervceller, som självständigt härledas från hPSCs. Men inte i fokus för detta protokoll, generering av ren populationer av astrocyter från hPSCs28 är ett viktigt steg och det kan vara tekniskt svårt om det görs utan tidigare erfarenhet. Detta första steg i generationen av dessa synaptic mikrokretsar bör utföras med noggrann timing och uppmärksam...

Astrocyter är en mycket riklig glial celltyp inom det centrala nervsystemet (CNS) med en mängd funktionella ansvar bortom strukturellt stöd. Genom utsöndring av lösliga synaptogenic faktorer och extracellulär matrix (ECM) komponenter, astrocyter stöd i upprättandet och klustring av mogen synapser under utveckling1. De också spelar en avgörande roll i att upprätthålla hälsa och plasticitet i synapser till extracellulära signalering2,3,4,5, och bidrar till långsiktiga stabilitet homeostatiska miljöer genom att reglera extracellulära kalium och glutamat, samt utsöndringen av energisubstrat och ATP6,7,8. Slutligen, de kan bidra till neurotransmission genom att påverka extrasynaptic strömmar9och kan indirekt påverka verksamhet genom andra celltyper som främjande myelinisering10. Ännu viktigare, eftersom abnormitet eller dysfunktion av astrocyter kan leda till många neurologiska syndrom och vuxen neuropatologi, finns det ett uppenbart behov av att inkludera astrocyter tillsammans med nervceller inom bakåtkompilerade neurala nätverk för en förbättrad modell av endogena hjärnan miljön. En integrerad kännetecken av astrocyter är deras förmåga att bilda dynamisk interaktion med nervcellernas synapser1,11,12. I avsaknad av glia bildar nervceller ett begränsat antal synapser, som i allmänhet också saknar funktionell mognad13.
Mänskliga astrocyter uppvisar morfologiska, transkriptionell och funktionella egenskaper — såsom ökad storlek och komplexitet av förgrenade, liksom artspecifika gener — som är inte återgetts i gnagare12,14, 15. Som ett resultat, studier utnyttja mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda neurala celler har blivit allmänt accepterat som ett medel för att undersöka CNS-relaterade sjukdomar i vitro samtidigt utveckla nya terapier, skada modeller och kultur paradigm16 ,17. Dessutom tillåter hPSCs studiet av mänskliga synaps bildning och funktion utan behov av primära vävnad18,19.
Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller av den mänskliga hjärnan. Det finns ett behov av en lämplig plattform för att sammanfatta dess synaptic nätverk med HiFi och reproducerbarhet. Nyligen, intresse vuxit fram i produktionen av 3D kultur system (allmänt känt som 'organoids,' 'spheroids' eller 'mini hjärnor')20 att modellera komplexa tredimensionella (3D) strukturer på cellulär och makro. 3D kultur system behåller ECM och cell-cell interaktioner som är normalt frånvarande eller begränsad under typiska 2D coculture paradigm21,22. Ett överflöd av tekniker finns för odling 3D neurala spheroids23,24,25; men många kräver långa kultur perioder (månader till år) för spontan utveckling och lager bevarande, med användaren uppvisar mycket liten kontroll över produktionen.
Här vi illustrera en systematisk metod för att snabbt och konsekvent bioengineer neurala interaktioner bland flera celltyper (pre differentierade nervceller och astrocyter) härstammar från hPSCs genom montering celler i området cocultures ('asteroider')26 som recapitulate mänskliga-specifika morfologiska komplexiteten i 3D. Detta högdensitets neurala system genererar jämnt spridda neurala undertyper som ta på mogen egenskaper över tiden och kan screening eller analyserats på ett sätt som hög genomströmning. Vi visar för första gången att mänskliga astrocyter inducerar synaptic burst nätverksaktivitet i dessa 3D cocultures. Detta protokoll är dessutom lätt att anpassa till generera sfärer av olika storlekar, att utnyttja celler som anges till olika regionala identiteter i CNS, och att studera interaktioner mellan flera andra celltyper som önskas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>Detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell plate</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti/anti</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys neuronal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5790</td>
			<td>Neurophysiological basal medium alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565-042</td>
			<td>With GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMH-1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>73634</td>
			<td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332100</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3072-1ml</td>
			<td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>7332500</td>
			<td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer or automatic cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td>Working concentration: 2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>DLAB</td>
			<td>8030170200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 System</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MEA2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Media Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen (Aqua Hold)</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>9804-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>169650025</td>
			<td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular glass cover slips</td>
			<td>Fisherfinest Premium Superslip</td>
			<td>12-545-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Detachment and passaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Working concentration: 10 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td>Working concentration: 2 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Culture Flask</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>Vented caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-A-zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>Detergent. Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 basal medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 supplements</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezrin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>MA5-13862</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glt1</td>
			<td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homer</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>160 011</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>188 004</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723</td>
			<td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab868</td>
			<td>Primary antibody; astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106 103</td>
			<td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TuJ1/&#946;3-tubulin (TUBB3)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Primary antibody; neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synaptic microcircuit modeling with 3d cocultures of astrocytes and neurons from human pluripotent stem cells

Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller för att studera den mänskliga hjärnan. En ny teknik som löser problemet är användningen av tre dimensionell (3D) neurala cellkulturer, kallas 'organoids' eller 'spheroids', för långsiktigt bevarande av intercellulära interaktioner inklusive extracellulära adhesionsmolekyler. Dessa kultur-system är dock tidskrävande och inte systematiskt genererade. Här vi detalj en metod för att snabbt och konsekvent producera 3D cocultures nervceller och astrocyter från mänskliga pluripotenta stamceller. Första, före differentierade astrocyter och neuronala stamfäder är separerade och räknade. Nästa, celler kombineras i sfär-bilda rätter med en Rho-tyrosinkinashämmare och specifika nyckeltal att producera sfärer av reproducerbara storlek. Efter flera veckor av kultur som flytande klot, är cocultures ('asteroider') Slutligen sektioneras för immunfärgning eller förkromad vid multielectrode matriser för att mäta synaptisk densitet och styrka. Det förväntas allmänt att detta protokoll kommer att ge 3D neurala sfärer som Visa mogen cell-typ begränsad markörer, bilda funktionella synapser och uppvisar spontana synaptic nätverksaktivitet burst. Tillsammans, tillåter detta system drogkontroll och utredningar av mekanismer av sjukdom i en mer lämplig modell jämfört med enskiktslager kulturer.

När de utförs korrekt, kommer att detta protokoll producera definierade populationer av funktionella cocultures astrocyter28,33,34 och nervceller35 genereras från hPSCs (figur 1A-1C), som detaljerade tidigare26 och beskrivs här i steg 2.1-2.2. Detta stegvis förfarande, med användning av mikrobrunn...

Watch this Scientific Journal Video about Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

I detta protokoll, vi strävar efter att beskriva en reproducerbar metod för att kombinera dissocierade mänskliga pluripotenta stamceller som härrör nervceller och astrocyter tillsammans i 3D sfär cocultures, bibehålla dessa sfärer i fri svävande villkor, och därefter mäta synaptic krets aktiviteten av sfärer med immunoanalysis och multielectrode array inspelningar.

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserade omprogrammering av mänskliga primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Övergående behandling av humana pluripotenta stamceller med DMSO för att främja differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...