Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par les NIH R01 EB014869.

1. préparation des cellules pour l’imagerie
Remarque : La sonde de force directe (DFP) peut être utilisée pour n’importe quel type de cellules adhérentes. Ici, les fibroblastes de souris NIH 3 t 3 sont utilisées comme la lignée cellulaire de modèle pour ce protocole.
<ol><li>Cellules de fibroblastes culture NIH 3 t 3 dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 10 % de sérum de bovin donneur et 1 % la pénicilline-streptomycine sur un fond de ver...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. 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K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

Mesurer l’intégration mécanique du noyau avec le cytosquelette est un défi pour les méthodes plus récentes, par exemple une micropipette aspiration16, car ils nécessitent deux noyaux isolés (où le noyau est découplé du cytosquelette) ou noyaux dans les cellules suspendues (où les forces extracellulaires, telles que les forces de traction, sont absents). Force a été appliquée au noyau en appliquant biaxiale souche aux adhérentes de cellules à une membrane17...

Pathologies telles que le cancer impliquent des modifications de forme nucléaire et composition1,2, qui sont généralement accompagnés par un ramollissement du noyau3,4. La résistance à la déformation mécanique nucléaire a été généralement caractérisée en appliquant une force de noyaux isolés5.
Le noyau dans les cellules est moléculairement relié au cytosquelette par l’éditeur de liens de Nucleoskeleton et cytosquelette (LINC) complexe6,7,8,9. Ainsi, le noyau est mécaniquement intégré avec le cytosquelette et, à travers les adhérences cellule-substrat, la matrice extracellulaire. Mécaniquement sonder le noyau à l’intérieur de cellules adhérentes peut donner un aperçu de cette intégration mécanique. Méthodes pour manipuler des noyaux dans les cellules vivantes incluent une micropipette aspiration10,11et la microscopie de force atomique12,13,14. Nous avons récemment décrit une sonde de force directe (DFP) qui s’applique à des forces mécaniques directement sur le noyau en une vie cellulaire adhérente15.
Ici, nous décrivons la procédure d’utilisation d’un système de micro-injection qui est couramment disponible dans les installations de microscopie d’appliquer une force mécanique de nano-échelle connue, directement vers le noyau dans une cellule adhérente. Un femtotip (0,5 µm de diamètre micropipette Astuce) est monté et raccordé au système de micro-injection par un tube. La pointe, placée à un angle de 45° par rapport à la surface de la boîte de Petri, est abaissée jusqu'à adjacente à la surface nucléaire. Le tube est ensuite déconnecté et ouvert à l’atmosphère, ce qui crée une dépression d’aspiration sur la surface nucléaire et scelle l’embout de micropipette contre la surface nucléaire. D’une traduction de la pointe d’une micropipette, le noyau est déformé et éventuellement (en fonction de l’ampleur de la force appliquée), détaché de la micropipette. Ce détachement se produit lorsque les forces de restauration (résister), exercées par le noyau et la cellule, égale à la force d’aspiration de la micropipette. Analyse peut être réalisée en mesurant le déplacement du noyau, la souche de longueur (équation 1), ou la souche de la région (Figure 1 a).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

Les propriétés mécaniques du noyau déterminent sa réponse aux forces mécaniques générées dans les cellules. Parce que le noyau est moléculairement continu avec le cytosquelette, les méthodes sont nécessaires pour sonder son comportement mécanique dans les cellules adhérentes. Ici, nous discutons la sonde force directe (DFP) comme outil d’employer la force directement vers le noyau dans une cellule adhérente vivante. Nous attachons une micropipette étroite à la surface nucléaire avec aspiration. Une micropipette est traduite loin du noyau, ce qui provoque le noyau à déformer et à traduire. Lorsque la force de rappel est égale à la force d’aspiration, le noyau se détache et élastique se détend. Parce que la pression d’aspiration est connue avec précision, la force sur la surface nucléaire est connue. Cette méthode a révélé que les forces de la nano-échelle suffisent à déformer et à traduire le noyau dans les cellules adhérentes et identifié des éléments du cytosquelette qui permettent le noyau à résister aux forces. Le DFP peut servir à disséquer les contributions des composantes cellulaires et nucléaires nucléaire propriétés mécaniques dans les cellules vivantes.

Figure 2 a montre le forçage d’un noyau de fibroblastes de souris de 3 t 3 NIH. Comme la pointe d’une micropipette est traduite vers la droite, le noyau se déforme et finit par se détache de l’extrémité de la micropipette. La souche de la longueur du noyau semble augmenter avec l’augmentation de la force d’aspiration (Figure 2 b). Le bord avant du noyau (en tirant avantage de micropipette) forme une protubérance n...

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A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode d’une micropipette pour appliquer directement une force contrôlée dans le noyau dans une cellule vivante. Ce dosage permet aux interrogatoires des propriétés mécaniques nucléaires dans la cellule vivante, adhérente.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Une méthode colorimétrique pour mesurer la teneur en fer chez les plantes

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...