Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EB014869.

1. preparare le celle per l'Imaging
Nota: La sonda di forza diretta (DFP) può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula aderente. Qui, fibroblasti NIH 3T3 del mouse sono usati come la linea cellulare modello per questo protocollo.
<ol><li>Cellule di cultura NIH 3T3 del fibroblasto dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino di donatore e 1% penicillina-streptomicina su un fondo di 35 mm vetro piatto fino al confluency di desiderata. Mantenere le cel...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. 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K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

L'integrazione meccanica del nucleo con il citoscheletro di misura è una sfida per i metodi più attuali, ad esempio micropipetta aspirazione16, perché richiedono entrambi nuclei isolati (dove il nucleo è disaccoppiato dal citoscheletro) o nuclei in cellule sospese (dove le forze extracellulari, quali le forze di trazione, sono assenti). Vigore è stato applicato al nucleo applicando deformazione biassiale a aderente celle a una membrana17,18...

Patologie come il cancro coinvolgono alterazioni nucleare forma e struttura1,2, che sono generalmente accompagnati da un 'addolcimento' del nucleo3,4. Nucleare resistenza alla deformazione meccanica è stata caratterizzata generalmente applicando una forza di nuclei isolati5.
Il nucleo in cellule è molecolarmente collegato al citoscheletro dal Linker di Nucleoskeleton e citoscheletro (LINC) complesso6,7,8,9. Di conseguenza, il nucleo è integrato meccanicamente con il citoscheletro e, attraverso le adesioni cellula-substrato, la matrice extracellulare. Meccanicamente sondando il nucleo all'interno di cellule aderenti può fornire la comprensione in questa integrazione meccanica. Metodi per manipolare i nuclei in cellule viventi includono micropipetta aspirazione10,11e a forza atomica microscopia12,13,14. Recentemente abbiamo descritto una sonda di forza diretta (DFP) che si applica forze meccaniche direttamente sul nucleo in un vivente cellulari aderenti15.
Qui, descriviamo la procedura per l'utilizzo di un sistema di microiniezione che è comunemente disponibile in strutture di microscopia di applicare una forza meccanica di nano-scala nota, direttamente al nucleo in una cellula aderente. Un femtotip (punta della micropipetta diametro di 0,5 µm) è montato e collegato al sistema di microiniezione di un tubo. La punta, posizionata ad un angolo di 45° rispetto alla superficie della piastra di coltura, si abbassa fino a adiacente alla superficie nucleare. Il tubo viene quindi disconnesso e aperto all'atmosfera, che crea una pressione negativa di aspirazione sulla superficie nucleare e sigilla la punta della micropipetta contro la superficie nucleare. Attraverso la traduzione della punta della micropipetta, il nucleo è deformato e alla fine (a seconda della grandezza della forza applicata), staccato dalla micropipetta. Questo distacco si verifica quando le forze antagoniste (resiste), esercitate dal nucleo e cella, uguale la forza di aspirazione applicata dalla micropipetta. Analisi può essere effettuata misurando lo spostamento del nucleo, il ceppo di lunghezza (equazione 1), o il ceppo di zona (Figura 1A).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

Le proprietà meccaniche del nucleo determinano la sua risposta a forze meccaniche generate nelle cellule. Poiché il nucleo è molecolarmente continuo con il citoscheletro, metodi sono necessari per sondare il suo comportamento meccanico in cellule aderenti. Qui, discutiamo la sonda di forza diretta (DFP) come strumento per applicare la forza direttamente al nucleo in una cellula aderente vivente. Noi attribuiamo una micropipetta stretta per la superficie nucleare con aspirazione. La micropipetta è traslata lontano il nucleo, che fa sì che il nucleo di deformare e tradurre. Quando la forza di ripristino è uguale alla forza di aspirazione, il nucleo si stacca e rilassa elasticamente. Poiché la pressione di aspirazione è noto con precisione, la forza sulla superficie nucleare è noto. Questo metodo ha rivelato che le forze su scala nanometrica sono sufficienti per deformare e tradurre il nucleo in cellule aderenti e identificati gli elementi del citoscheletro che consentono il nucleo resistere alle forze. La DFP può essere utilizzata per sezionare i contributi di componenti cellulari e nucleare nucleare proprietà meccaniche in cellule viventi.

La Figura 2A Mostra la forzatura di un nucleo di fibroblasto NIH 3T3 del mouse. Come la punta di una micropipetta è tradotto a destra, il nucleo si deforma e alla fine si stacca dalla punta della micropipetta. Il ceppo di lunghezza del nucleo è visto ad aumentare con l'aumento della forza di aspirazione (Figura 2B). Il bordo anteriore del nucleo (micropipetta tirando bordo) forma una protrusione nucleare ed il bordo d'uscita è...

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A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

In questo protocollo, descriviamo un metodo micropipetta per applicare direttamente una forza controllata al nucleo in una cellula vivente. Questo test permette di interrogatorio di proprietà meccaniche nucleari nella cellula viva, aderente.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

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