Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
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この作品は、NIH R01 EB014869 によって支えられました。

1. イメージング用細胞を準備
注: 任意の付着性のセルのタイプの直接力プローブ (DFP) を使用できます。ここでは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞は、このプロトコルのモデル細胞ラインとして使用されます。
<ol><li>文化 NIH 3T3 線維芽細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1% と 10% ドナー牛血清ペニシリン-ストレプトマイシン 35 ミリメートルのガラスの下に目的の conflu...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+and+heterochromatin:+a+complex+relationship.">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li><li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures.">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li><li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins.">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li><li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope.">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li><li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin-2G,+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex,+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension.">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li><li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency.">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li><li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope.">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li><li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency.">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy.">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li><li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy.">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).</li><li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell.">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li><li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引16など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が?...

癌などの疾患は、核の形状と構造1,2, '' 核3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核5に力を適用することで一般的に特徴づけられています。
細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引10、11、および原子間力顕微鏡12,13,14生きた細胞中の核を操作するメソッドが含まれます。最近生活付着性のセル15に核に直接機械的な力を適用する直接力プローブ (DFP) について述べる。
ここでは、我々 は付着性細胞の核に直接知られているナノ機械的な力を適用する顕微鏡施設で利用可能なインジェクション システムを使用する手順を概説します。Femtotip (0.5 μ m 径マイクロ ピペット チップ) がマウントされ、チューブでのインジェクション システムに接続されています。まで核の表面に隣接して、培養皿の表面に対して 45 ° の角度で配置されている、先端が低下します。チューブは切断し、核の表面に負の吸引圧を作成し、核の表面に対してマイクロ ピペット先端をシール大気開放します。マイクロ ピペット チップの翻訳を通じて核は変形し、最終的に (力の大きさ) によって、マイクロ ピペットを切り離します。この剥離は、核および細胞、によって出される、復元 (耐熱) 力、ピペットによって適用される吸引力の等しい場合に発生します。核の変位を測定することによって分析を行うことが長さひずみ (式 1)、または領域のひずみ (図 1 a)。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。

図 2 aは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞核の強制を示しています。マイクロ ピペット チップの右側に翻訳核変形、最終的にマイクロ ピペット チップから切り離します。吸引力 (図 2 b) とともに増加する核の長さのひずみが見られます。核 (端を引っ張ってマイクロ ピペット) の前面の端を形成する核の突起とトレーリング エッ?...

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A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...