Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
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이 작품은 NIH R01 EB014869에 의해 지원 되었다.

1. 영상에 대 한 셀을 준비합니다.
참고: 직접 힘 프로브 (DFP) 모든 부착 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여기, NIH 3T3 마우스 fibroblasts 모델 셀 라인으로이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다.
<ol><li>문화 NIH 3T3 fibroblast 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 1%와 10% 기증자 소 혈 청 보충 페니실린-스 35 m m 유리 하단에 원하는 confluency까지 요리. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합?...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. 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K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부16, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제...

암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조1,2, 일반적으로 동반 된다 핵3,4의 '연'을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵5에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.
셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부10,11및 원자 힘 현미경 검사 법12,,1314있습니다. 우리는 최근 생활 부착 셀15에 핵에 직접 기계적인 힘을 적용 하는 직접 힘 프로브 (DFP)를 설명 합니다.
여기, 우리가 일반적으로 알려진된, 나노 기계적 힘을 부착 셀에서 핵 직접 적용할 현미경 시설에서 사용할 수 있는 microinjection 시스템을 사용 하기 위한 절차를 설명 합니다. Femtotip (0.5 µ m 직경 micropipette 팁) 탑재 하 고 튜브에 의해 microinjection 시스템에 연결 된. 때까지 핵 표면에 인접 한 문화 접시의 표면에 상대적으로 45 ° 각도로 위치 팁은 낮 췄 다. 튜브 분리 그리고 핵 표면에 부정적인 흡입 압력을 만들고 물개 micropipette 팁 핵 표면에 대 한 분위기에 열입니다. Micropipette 팁의 번역을 통해 핵 변형 이며 결국 (적용 되는 힘의 크기), 따라는 micropipette에서 분리. 이 분리는 micropipette에 의해 적용 되는 흡입 힘 동등 하 게 복원 (저항) 세력, 핵 및 셀에 의해 발휘 될 때 발생 합니다. 핵의 변위를 측정 하 여 분석을 수행할 수 있습니다 길이 변형 (공식 1), 또는 지역 스트레인 (그림 1A).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.

그림 2A 는 NIH 3T3 마우스 구와 핵의 강제로 보여줍니다. Micropipette 팁은 오른쪽에 번역, 핵 변형 하 고 결국 micropipette 팁에서 분리. 핵의 길이 변형 흡입 힘 (그림 2B) 증가 함께 증가를 볼 수 있다. 핵 (micropipette 당기는 가장자리)의 앞쪽 가장자리 핵 돌출을 형성 하 고 후행 가장자리 그것의 원래 위치에서 난민. 돌출의 길이 후행 ?...

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A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...