Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 EB014869.

1. preparar células para a imagem latente
Nota: A sonda de força direta (DFP) pode ser usada para qualquer tipo de células aderentes. Aqui, fibroblastos de rato do NIH 3T3 são usados como a linha celular do modelo para este protocolo.
<ol><li>Células de fibroblastos cultura NIH 3T3 em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro de bovino doador e 1% penicilina-estreptomicina em um fundo de vidro 35mm prato até confluência desejada. Manter as células em 37...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+and+heterochromatin:+a+complex+relationship.">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li><li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins.">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li><li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope.">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li><li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin-2G,+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex,+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension.">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li><li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency.">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li><li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope.">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li><li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency.">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy.">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li><li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy.">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).</li><li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell.">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li><li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

Medindo a integração mecânica do núcleo com o citoesqueleto é um desafio para métodos mais atuais, como micropipeta aspiração16, pois eles exigem ou núcleos isolados (onde o núcleo é dissociado do citoesqueleto) ou núcleos em células suspensos (onde forças extracelulares, como forças de tração, estão ausentes). Força aplicou-se para o núcleo aplicando tensão biaxial de aderente de células a uma membrana17,,18; no enta...

Patologias como câncer envolvem alterações à forma nuclear e estrutura1,2, que geralmente são acompanhados de um amolecimento do núcleo3,4. Nuclear resistência à deformação mecânica tem sido geralmente caracterizada pela aplicação de uma força de núcleos isolados5.
O núcleo nas células molecularmente está ligado ao citoesqueleto pelo vinculador de Nucleoskeleton e citoesqueleto (LINC) complexo6,7,8,9. Como resultado, o núcleo mecanicamente é integrado com o citoesqueleto e, através de aderências célula-substrato, a matriz extracelular. Mecanicamente, sondar o núcleo no interior das células aderentes pode fornecer insights sobre essa integração mecânica. Métodos para manipular os núcleos em células vivas incluem micropipeta aspiração10,11e microscopia de força atômica a12,13,14. Recentemente descrevemos uma sonda de força direta (DFP) que se aplica forças mecânicas diretamente no núcleo em uma vida aderentes célula15.
Aqui, podemos descrever o procedimento para usar um sistema de microinjeção que está geralmente disponível em instalações de microscopia para aplicar uma força mecânica de nano-escala conhecida, diretamente para o núcleo em uma célula aderente. Um femtotip (0,5 µm ponta de micropipeta de diâmetro) é montado e ligado ao sistema de microinjeção por um tubo. A ponta, posicionada em um ângulo de 45° em relação à superfície do prato, cultura é abaixada até adjacente à superfície nuclear. O tubo é então desligado e aberto para a atmosfera, o que cria uma pressão negativa de sucção na superfície nuclear e lacra a ponta da micropipeta contra a superfície nuclear. Através da tradução da ponta da micropipeta, o núcleo é deformado e eventualmente (dependendo da magnitude da força aplicada), extraído da micropipeta. Este desprendimento ocorre quando as forças de restaura (oposição), exercidas pelo núcleo e célula, igual a força de sucção aplicada pela micropipeta. Análise pode ser realizada medindo-se o deslocamento do núcleo, a estirpe de comprimento (equação 1), ou a tensão da área (figura 1A).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

As propriedades mecânicas do núcleo determinam sua resposta às forças mecânicas geradas nas células. Porque o núcleo é molecularmente contínuo com o citoesqueleto, métodos são necessários para sondar seu comportamento mecânico em células aderentes. Aqui, vamos discutir a sonda de força direta (DFP) como uma ferramenta para aplicar a força diretamente para o núcleo em uma célula aderente viva. Atribuímos uma micropipeta estreita à superfície nuclear com sucção. A micropipeta é traduzida longe do núcleo, o que faz com que o núcleo se deforma e traduzir. Quando a força restauradora é igual à força de sucção, o núcleo desconecta e elasticamente, relaxa. Porque o pressão de sucção é precisamente conhecido, é conhecida a força na superfície nuclear. Este método revelou-se que as forças de nano-escala são suficientes para deformar-se e traduzir o núcleo nas células aderentes e identificaram elementos do citoesqueleto que permitem que o núcleo resistir às forças. O DFP pode ser usado para dissecar as contribuições dos componentes celulares e nucleares para propriedades mecânicas nucleares em células vivas.

Figura 2A mostra a força de um núcleo de fibroblasto NIH 3T3 rato. Como a ponta da micropipeta é traduzida para a direita, o núcleo deforma e eventualmente desanexa da ponta da micropipeta. A estirpe do comprimento do núcleo é vista a aumentar com o aumento da força de sucção (Figura 2B). Na extremidade dianteira do núcleo (micropipeta puxando a borda) forma uma protusão nuclear e a borda direita é deslocada de sua po...

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A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...