Name: a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R01 EB014869.

1. Подготовка клетки для изображений
Примечание: Прямой силы зонд (DFP) может использоваться для любого типа адэрентных клеток. Здесь фибробласты мыши низ 3T3 используются в качестве модели клеточная линия для этого протокола.
<ol><li>Культура низ 3T3 фибробластов клетки в Дуль?...

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+and+heterochromatin:+a+complex+relationship.">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li><li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures.">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li><li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins.">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li><li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope.">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li><li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin-2G,+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex,+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension.">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li><li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency.">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li><li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope.">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li><li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency.">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy.">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li><li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy.">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).</li><li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell.">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li><li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

Измерительные механические интеграции ядра с цитоскелета является проблемой для наиболее текущие методы, такие как микропипеткой стремление16, потому что они требуют либо отдельных ядер (где ядро отделенных от цитоскелета) или ядер в подвесной клетки (где внеклеточного си...

Патологий, таких как рак включают изменения в ядерной форма и структура1,2, которые обычно сопровождаются «размягчения» ядра3,4. Ядерные устойчивость к механической деформации обычно характеризуются применения силы для изолированных ядер5.
Ядро в клетках молекулярно подключен к цитоскелета компоновщик Nucleoskeleton и цитоскелета (линк) комплекс6,,78,9. В результате ядро механически интегрирована с цитоскелета и через ячейки субстрат спайки, внеклеточного матрикса. Механически зондирования ядра внутри адэрентных клеток может обеспечить понимание этой механической интеграции. Методы для манипулирования ядер в живых клетках включают микропипеткой аспирации10,11и атомно-силовой микроскопии12,,1314. Мы недавно описал прямой силы зонд (DFP), который применяется непосредственно на ядро в живых адэрентных клеток15механических сил.
Здесь мы приводим порядок использования микроинъекции системы, которая обычно доступна в микроскопии средств для применения известных, нано-механической силы непосредственно к ядру в адэрентных клеток. Femtotip (0,5 мкм диаметром микропипеткой наконечник) установлен и подключен к системе микроинъекции трубку. Кончик, расположены под углом в 45° по отношению к поверхности культуры блюдо, опускается до прилегающих к ядерной поверхности. Трубка затем отключен и открыт для атмосферы, которая создает отрицательное давление всасывания на поверхности ядерной и уплотнения кончик микропипеткой против ядерной поверхности. Через перевод кончика микропипеткой ядро деформируется и в конечном итоге (в зависимости от масштабов применения силы), отделен от микропипеткой. Этот отряд возникает, когда восстановление (сопротивления) сил, оказываемое ядро и ячеек, равное всасывающее усилие микропипеткой. Анализ может выполняться путем измерения смещения ядра, длина штамм (уравнение 1), или площадь штамм (рис. 1A).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

Механические свойства ядра определяют свой ответ на механических сил, созданных в клетках. Поскольку ядро молекулярно непрерывный с цитоскелета, методы необходимы для зонда его механического поведения в адэрентных клеток. Здесь мы обсуждаем прямой силы зонд (DFP) как инструмент для применения силы прямо к ядру в живых адэрентных клеток. Мы придаем узкие микропипеткой ядерной поверхности с всасывания. Микропипеткой переводится от ядра, который вызывает ядро деформируется и перевести. Когда восстановление сил равна силе всасывания, ядро отсоединяется и упруго расслабляет. Потому что давление всасывания точно известно, известно на поверхности ядерных сил. Этот метод показал, что нано-силы достаточно, чтобы деформировать и перевести ядро в адэрентных клеток и определены цитоскелетных элементов, которые включают ядро противостоять силам. DFP может использоваться для рассечения вклад сотовой и ядерных компонентов ядерных механических свойств в живых клетках.

Рисунок 2A показывает, заставляя ядра фиброцита мыши 3T3 низ. Как микропипеткой кончика перевели справа, ядро деформируется и в конечном итоге отсоединяется от кончика микропипеткой. Считается, что длина напряжение ядра с увеличением силы всасывания (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton at JoVE.com

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

В этом протоколе мы описываем метод микропипеткой непосредственно применять контролируемых силой к ядру в живой клетке. Этот assay позволяет допроса ядерных механических свойств в живых, адэрентных клеток.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...